1.  如果擴增曲線ct值比較靠后的話,，32左右,，一般有什么方法解決沒有

ct值比較靠后,，對實驗有一定的影響,，因為經(jīng)過那么多次的循環(huán),，酶的活性有可能有所下降,，這時候擴增效率會有所改變（而定量PCR的理論基礎(chǔ)就是每次循環(huán)的擴增效率我們認為是確定的一個值）。因此能夠把ct值往前移,。
 

解決辦法可以將模板加以濃縮或者抽干之后用少量水去溶解,。

2. 為什么合成的引物做不加摸板的對照也能擴增出目的條帶，而內(nèi)參用同樣體系就沒有呢?

引物被污染,。

3. 實時定量PCR,，熒光定量PCR，實時熒光定量PCR,，real－time PCR,，這些是不是同一個概念

是一個概念。

4. 我的標準曲線的slope總是大于４,，而且每個梯度的平行ct值差別比較大,，原因？

這個斜率是＝1/LOG 10(擴增效率),，理論上擴增效率＝2,，斜率是3.322。如果斜率大于4,，說明擴增效率比較小,。可以考查一下反應(yīng)體系是否合理,？酶活是否正常,？
 

平行管的CT值差別大可以考查一下自己實驗操作是否規(guī)范，另外一種原因就是儀器本身的誤差也可能會導致CT值差別比較大,。

當斜率為4的時候,，擴增效率是77.8%，斜率大于4的話,，效率繼續(xù)下降,。
 

擴增效率的問題實際就是引物的擴增效率，可能酶活的關(guān)系沒有那么重要,，前提是試劑盒的質(zhì)量有保證,。回到擴增效率，只有在引物和模板處于zui適比例時才能得到比較滿意的擴增效率,，因此通過調(diào)節(jié)PCR反應(yīng)體系中的引物終濃度來解決,，可以做一些引物梯度來比較。

5. ROX染料是什么作用,？

ROX的作用ABI宣稱是用來校準加樣誤差的,。
 

但是據(jù)說ROX的作用實際上是用來校準光程差的。即每個孔的熒光信號經(jīng)過濾光片在經(jīng)過聚焦到CCD的時候,，走過的光程是不一樣的,，這樣在CCD上成像的亮度就不一樣了。所以需要把這個差異用ROX來計算孔間差異有多大,，然后差異系數(shù)去處理,，實際的熒光信號。具體過程我不是非常清楚,，請高手指正,。

6. 熒光定量PCR的基線，是怎么確定的呢,？

基線就是背景值,，因此就是曲線在沒有“起跳”之前的一段。在軟件上有一個地方可以輸入baseline從第幾到第幾cycle作為基線,。設(shè)置原則是使沒有起跳之前zui多的cycle的信號接近0,。

7. 我剛準備做定量，請教一下,，不知道伯樂的機子怎么樣,？請推薦幾個合適的ＳＹＢＲ　ＧＲＥＥＮ的盒子,，１０００以內(nèi)的（沒錢不好辦?。掖蠹s做２０個樣?，F(xiàn)在對ＳＹＢＲ?。牵遥牛牛握J可嗎？

伯樂的機子不錯,。takara的試劑盒,，大概在1500元，400個反應(yīng),。大部分人做還是用sybr green I的。這是zui常用的染料,。