檢測(cè)方法

利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法用食品及飼料中三聚氰胺的定量測(cè)定。

檢測(cè)原理

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法定量測(cè)定三聚氰胺殘留,。利用萃取液通過均質(zhì)及振蕩的方式提取樣品中的三聚氰胺進(jìn)行免疫測(cè)定,。先將三聚氰胺酶標(biāo)記物,，樣品萃取物及標(biāo)準(zhǔn)加入到已經(jīng)包被有三聚氰胺抗體的微孔中開始反應(yīng),。在30分鐘的孵育過程中，樣品萃取物中的三聚氰胺與三聚氰胺酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合微孔中的三聚氰胺抗體,，孵育30分鐘后洗掉小孔中所有沒有結(jié)合的三聚氰胺及三聚氰胺酶標(biāo)記物,。在用去離子水清洗結(jié)束后，每孔中加入清澈的底物溶液,，結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的底物轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的物質(zhì),。孵育30分鐘后停止此反應(yīng)，根據(jù)各孔顏色深淺進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取,。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的顏色得出樣品中三聚氰胺的的濃度值,。

實(shí)驗(yàn)所需設(shè)備及材料

三聚氰胺檢測(cè)試劑盒（目前常用進(jìn)口試劑有美國Abraxis公司和美國Beacon公司的）
酶標(biāo)儀一臺(tái)（配有450nm濾光片）
1－5ml可調(diào)移液器
100－1000ul可調(diào)移液器.
20－200ul可調(diào)移液器.

蒸餾水或去離子水..
可吸取50ul的移液器及吸頭.
可吸取50ul和100ul的八道移液器及吸頭.
吸水紙或相當(dāng)?shù)奈牧?
450nm的酶標(biāo)儀.
計(jì)時(shí)器.
洗瓶
混旋器.
20mM PBS： 0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl ,蒸餾水定容至1000ml.


注意事項(xiàng)
配套使用試劑，不要同其它公司的產(chǎn)品混用,，不要將不同批次的產(chǎn)品混用,。
樣品稀釋或含有雜質(zhì)很可能對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性有影響。
不要使用過期的產(chǎn)品,。
使用之前將所有試劑回升至室溫,，但不要放置超過24小時(shí)。
三聚氰胺屬于有毒性的化學(xué)品,，請(qǐng)小心處理,。
停止液是1N鹽酸，避免接觸皮膚,。 

樣品制備 （以美國Beacon試劑為例）
濕的寵物食品萃取方法（稀釋倍數(shù)：100）
均質(zhì)樣品至布丁狀,。
稱取2g樣品加入10mL 60%甲醇/水溶液，并劇烈振蕩,。
超聲萃取1分鐘。
漩渦混合1分鐘,，然后靜置5分鐘,，使樣品分層。
3000 g 室溫離心5分鐘,。
用玻璃纖維濾紙過濾上清液,，并將萃取液收集于一干凈試管中。
用樣品稀釋液將濾液20倍稀釋（如：0.1mL濾液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS）
移取150 ul 進(jìn)行分析,。
注意：用此方法測(cè)定了8個(gè)添加有15ppm三聚氰胺的貓糧（非要求召回）,，回收率范圍為75%-117%。
本方法只可作為樣品篩選方法,，不可作為zui終確認(rèn)方法,。

小麥面筋蛋白萃取方法：（稀釋倍數(shù)：500）
1.均質(zhì)或混勻小麥面筋蛋白樣品。
2.稱取0.2g均質(zhì)好的樣品加入10mL 酸化的60%甲醇/水溶液（1mL 1N HCl/ 100mL 60%甲醇/水）,。
3.漩渦混合并超聲萃取,，使樣品溶解（確保樣品中沒有結(jié)塊）,。
4.用樣品稀釋液稀釋萃取液按照1:10比例。（0.5mL+4.5mL 10%MeOH/20 mM PBS）,。
5.10000轉(zhuǎn)/分離心上清液10分鐘,。
6.用G6玻璃纖維濾紙過濾上清液，并將萃取液收集于一干凈試管中,。
7.移取150 ul 進(jìn)行分析,。

注意：如果樣品中含有大量的添加物，需要加入更大量的萃取溶液,，以保證萃取效率,。
操作人依據(jù)自己的判斷力，如果測(cè)試結(jié)果比較高,，需要加入兩倍的萃取溶液（0.2/20mL）,，進(jìn)行二次測(cè)定。

干的寵物食品萃取方法（稀釋倍數(shù)：200）
1.質(zhì)器均質(zhì)干的寵物飼料樣品,。
2.稱取1g樣品加入10mL 60%甲醇/水溶液,，并劇烈振蕩。
3.超聲萃取1分鐘,。漩渦混合1分鐘,，然后靜置5分鐘，使樣品分層,。
4.3000 g 室溫離心5分鐘,。
5.用G6玻璃纖維濾紙過濾上清液，并將萃取液收集于一干凈試管中,。
6.用樣品稀釋液將濾液20倍稀釋（如：0.1mL濾液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS）
7.移取150 ul 進(jìn)行分析,。

免疫測(cè)定過程 （注意: 標(biāo)準(zhǔn)及樣品做平行試驗(yàn)以增加準(zhǔn)確度）
將所有試劑及樣品回升至室溫20-280C，但不要放置超過24小時(shí),。
從鋁箔袋中拿出要求數(shù)量的微孔條,，放入干燥劑并重新封好袋子以免微孔條受潮
吸取150ul標(biāo)準(zhǔn)、樣品到對(duì)應(yīng)微孔中,，必須保證每種溶液使用干凈的吸頭吸取,，避免交叉污染。 加入50ul三聚氰胺酶標(biāo)記溶液到每個(gè)小孔中,。
混合60秒,，20-28攝氏度下孵育30分鐘。
將微孔中的溶液倒入水槽中,，用蒸餾水*充滿微孔,，震蕩后倒掉，重復(fù)三次，總共四次洗板,。
在吸水紙上拍打,，盡可能將水拍干。
每個(gè)微孔中加入100ul底物溶液,。
20-28攝氏度下,，孵育30分鐘。
每個(gè)微孔中加入100ul停止液,。
450nm下讀板,。

結(jié)果分析
半定量的結(jié)果是由樣品的吸光率與標(biāo)準(zhǔn)的吸光率的簡(jiǎn)單對(duì)比而來判定:樣品的顏色比標(biāo)準(zhǔn)的顏色淺則三聚氰胺的濃度比標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度高, 樣品的顏色比標(biāo)準(zhǔn)的顏色深則三聚氰胺的濃度比標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度低。
定量分析需要繪制以標(biāo)準(zhǔn)樣的吸光率為X軸,以標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度的半對(duì)數(shù)為Y軸的曲線圖.依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣吸光率的點(diǎn)畫成一直線,如此樣品的光吸收率可在線上找到,與此相對(duì)應(yīng)的Y軸則為樣品的濃度,樣品光吸收率范圍應(yīng)比標(biāo)準(zhǔn)樣的zui底范圍高,比zui高范圍低, 即可說明此樣品中三聚氰胺的含量大于500ppb或小于20ppb,。