RNA 甲基化是表觀遺傳學(xué)內(nèi)容的重要內(nèi)容之一,， 其中 m6A（N6-methyladenosine，6- 甲基腺嘌呤,，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖 1）較為常見的一種修飾方式,。m6A 是一種動態(tài)可逆的修飾方式,，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮作用，其在調(diào)控基因表達(dá),、剪接,、RNA 編輯、RNA 穩(wěn)定性,、控制 mRNA 壽命和降解,、介導(dǎo)環(huán)狀 RNA 翻譯 [1] 等方面扮演重要角色，具有重要的研究意義（見圖 2）,。

圖 1.6- 甲基腺嘌呤化學(xué)結(jié)構(gòu)及可逆反應(yīng)過程

圖 2. 動態(tài)修改的 m6A 修飾及介導(dǎo)的生物學(xué)功能 [2]

M6A 甲基化修飾是由一個多蛋白復(fù)合物介導(dǎo)產(chǎn)生,，目前已知這個復(fù)合物的成分包括 METTL3，METTL14 和 WTAP,；而負(fù)責(zé)擦除甲基化修飾基團(tuán)的則由去甲基化酶 FTO 和 ALKBH5 所承擔(dān),。在細(xì)胞核中的 HNRNPC 負(fù)責(zé)識別 m6A 修飾基團(tuán)，并介導(dǎo) mRNA 前體的選擇性剪接,。而另外一個 m6A 識別蛋白 HNRNPA2B1[3] 則促進(jìn) pri-miRNA 加工成 pre-miRNA,。在細(xì)胞質(zhì)中，不同的 M6A 位點(diǎn)識別蛋白介導(dǎo)不同的功能,。YTHDF1 和 YTHDF3[4,5] 識別 m6A 修飾 mRNA,，通過與起始因子及核糖體相互作用促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯，eIF3 識別蛋白也會直接綁定到 mRNA5’UTR 端的 m6A 位點(diǎn)參與翻譯起始,。而另外一個識別蛋白 YTHDF2 與 m6A 識別將導(dǎo)致 mRNA 的降解,。目前還存在其他未知的 m6A 識別蛋白，相關(guān)研究的繼續(xù)開展將有利于解開 m6A 在 mRNA 運(yùn)輸,、翻譯和存儲等功能的謎團(tuán),。

雖然 RNA 甲基化的研究在上世紀(jì)七十年代就開始,，但是由于技術(shù)上的局限一直停滯不前,，直到zui近幾年在何川教授等團(tuán)隊的帶領(lǐng)下，通過不斷的技術(shù)創(chuàng)新和難點(diǎn)攻克,，m6A 等甲基化修飾的研究才不斷取得突破性的研究成果,。

關(guān)于 m6A 的研究方向，主要涉及 m6A 本身的修飾過程涉及的甲基化酶和去甲基化酶,，以及 m6A 識別蛋白,。這個研究方向的研究技術(shù)難度較大,，涉及較多生化實驗。其次是 m6A 修飾譜構(gòu)建及作用機(jī)制,，特別是構(gòu)建疾病細(xì)胞模型或者發(fā)病組織的 m6A 修飾譜,，涉及較為關(guān)鍵的 MeRIP-seq (methylated RNA immunoprecipitation sequencing) 高通量測序技術(shù) [6]。第三個方向是 m6A 修飾失衡介導(dǎo)相關(guān)基因異常（可變剪切,、穩(wěn)定性,、翻譯、miRNA 調(diào)控）在所發(fā)揮的作用,。第四個方向是通過大數(shù)據(jù)分析,，利用公共數(shù)據(jù)資源對 m6A 修飾涉及的基因進(jìn)行表達(dá)量統(tǒng)計，并進(jìn)行共表達(dá)分析預(yù)測其可能調(diào)控的靶基因,，進(jìn)而進(jìn)行功能驗證,。（見圖 3）

圖 3. m6A 的主要研究方向

下面我們將重點(diǎn)介紹其中一種研究方向的設(shè)計思路，并提供相應(yīng)的技術(shù)服務(wù)和解決方案,。

研究方向：構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組 m6A 修飾圖譜

研究目的：構(gòu)建目標(biāo)樣本的 m6A 修飾譜,，揭示在特定生命過程或者疾病模型中的 m6A 圖譜。

實驗樣本：細(xì)胞,、組織,、提取后的總 RNA（限定有參基因組物種）

關(guān)鍵技術(shù)：meRIP-seq (methylated RNA immunoprecipitation sequencing)，也稱 m6A-seq

zui近幾年來 m6A 研究迅速發(fā)展,，正是得益于 meRIP-seq 技術(shù)的開發(fā)及應(yīng)用,。meRIP-seq 高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，能夠檢測全轉(zhuǎn)錄組不同的 RNA 甲基化,，是成功發(fā)現(xiàn) RNA 甲基化機(jī)理及功能的關(guān)鍵技術(shù),。

MeRIP-seq 技術(shù)將甲基化 DNA 免疫共沉淀 (methylated DNA immunoprecipitation， MeDIP) 技術(shù),、RNA 結(jié)合蛋白免疫共沉淀 (RNA immunoprecipitation,，RIP) 技術(shù)和 RNA 測序 (RNA sequencing，RNA-seq) 技術(shù)組合起來,，高精度地檢測全基因組 (或全轉(zhuǎn)錄組) 范圍內(nèi)的 RNA 甲基化,。MeRIP-seq 技術(shù)采用免疫共沉淀方法，即甲基化 RNA 特異性抗體與被隨機(jī)打斷的 RNA 片段進(jìn)行孵育,，抓取有甲基化修飾的片段進(jìn)行測序,；同時需要平行測序一個對照 (control) 樣本，對照樣本用于消除抓取帶有甲基化片段過程中的背景,。然后將免疫共沉淀 (IP) 樣本和對照樣本中的序列片段對比 (或定位) 到參考基因組 / 轉(zhuǎn)錄組上,，檢測 RNA 甲基化位點(diǎn)。對照樣本測量對應(yīng) RNA 的表達(dá)量，本質(zhì)上是 RNA-seq 數(shù)據(jù) (圖 4)[7],。

圖 4 .MeRIP-seq 技術(shù)檢測 m6A 技術(shù)流程 [4]

實驗分組設(shè)置：

細(xì)胞模型 實驗組 VS 對照組,，建議 3:3

組織模型 正常組 VS 疾病組，建議 5:5

組內(nèi)對照：IP 組 VS in put 組 *

注 *：input 組主要用于比較鑒定 IP 組的抗體特異性結(jié)合,，是*的組分

測序模式：PE100/150

測序數(shù)據(jù)：3-6G

關(guān)鍵分析內(nèi)容：m6A 的基本特征

m6A 修飾基本特征分析主要包括以下三個方面

特征一,、peak 在基因元件的分布

本分析主要通過對測序數(shù)據(jù)比對后，分析相關(guān)序列在基因不同原件的分布,。主要方法是將 5-UTR,，CDS，3-UTR 各劃分為等長的 20 個 bin,，統(tǒng)計 peak 落在每個 bin 中 peak 的百分比,。Peak 和 bin 的 overlap 長度占 50% 以上就算落在了這個 bin 上?；蛟植紙D見圖 5,、圖 6：

圖 5 Peak 在元件中的分布曲線圖。綠色表示 CDS,，藍(lán)色表示 UTR,，灰色的細(xì)線表示 start-coden 的起始位點(diǎn)和 stop-coden 的終止位點(diǎn)

圖 6 Peak 分布條形圖 ， 橫坐標(biāo)表示各元件,，縱坐標(biāo)表示落在元件中的 peak 百分比

特征二,、 reads 在基因元件的分布

找到富集區(qū)域（peak）后，統(tǒng)計 reads 在元件中的分布情況,。針對 peak,，分別提取 IP 和 Input 在 peak 區(qū)間的 reads，reads 和 peak overlap 上 50% 以上就算 reads 落在 peak 區(qū)間 , 同時 normalized IP 和 Input 的數(shù)據(jù)量比例,。(如圖 7)

圖 7 reads 在元件中的分布曲線圖,。綠色表示 CDS，藍(lán)色表示 UTR,，,，縱坐標(biāo)表示 normalized 后的覆蓋深度

特征三、Peak 關(guān)聯(lián)基因的特征

針對 Peak 關(guān)聯(lián)上的基因 ,， 看它的 stop-coden,、start-coden 是否有 m6A 富集區(qū)域 （peak）， 以此將 gene 分為 4 類：PeakStart (m6A peaks around start codon), PeakStop (m6A peaks around stop codon), PeakBoth (m6A peaks around both start and stop codons) and others,。

圖 8 peak 關(guān)聯(lián)基因特征 pie 圖

兩樣品 peak overlap 占 50% 以上則定義為 common peak,， 其他的定義為 special peak。共有和* peak 的韋恩圖如下 (見圖 9)：

圖 9 兩樣本 peak 韋恩圖

通過 以上的 m6A 特征分析,，后續(xù)的重要分析還包括針對差異 peak 來分析關(guān)聯(lián)的基因,，以及對這些基因進(jìn)行 GO 和 KEGG 分析,。其次,，還可以針對目前的研究熱點(diǎn),，對 peak 進(jìn)行 circRNA 分析，有利于指導(dǎo)環(huán)狀 RNA 翻譯功能的研究工作 [1],。

另外,，通過和同組樣本轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析，可以進(jìn)一步深挖 m6A 修飾對可變剪切,、RNA 編輯,、RNA 表達(dá)豐度、miRNA 加工生成等方面的影響,；也可以結(jié)合蛋白質(zhì)譜定量檢測,，研究 m6A 修飾與蛋白質(zhì)翻譯的關(guān)系，指導(dǎo)進(jìn)一步的深入功能機(jī)制研究,。

自 2011 年何川教授發(fā)表 FTO 作為 m6A 去甲基化酶 [8] 的研究工作以來,，m6A 的研究深度和廣大快速發(fā)展。為了幫助國內(nèi)生物醫(yī)學(xué)特別是腫瘤領(lǐng)域的科研人員更好的理清 m6A 的研究思路,，表觀生物制定以下疾病相關(guān) m6A 研究策略以供參考,。

研究案例： FTO 通過 RNA 修飾機(jī)制發(fā)揮促癌作用

2017 年 1 月，辛辛那提大學(xué)研究人員在 Cancer Cell 雜志發(fā)表論文 [9],，報道了發(fā)現(xiàn)肥胖相關(guān)蛋白 FTO 能夠通過 RNA 修飾機(jī)制調(diào)節(jié)一系列基因的表達(dá),，發(fā)揮重要的促癌作用，導(dǎo)致白血病細(xì)胞增多并抑制癌細(xì)胞對藥物的應(yīng)答,。

研究人員利用 100 個人類急性髓系白血?。ˋML）樣本以及 9 個正常對照樣本的芯片數(shù)據(jù)，還對其他一些大規(guī)模 AML 樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析,。他們發(fā)現(xiàn) FTO 在不同亞型的白血病樣本中都存在高表達(dá),。（見圖 10）

圖 .10 FTO 基因在 AML 樣本中存在高表達(dá)

圖 11. FTO 靶向調(diào)控 ASB2 和 RARA 等抑制白血病細(xì)胞生長的基因，通過去甲基化修飾后,，反向抑制 ASB2 和 RARA 的功能

實驗證明 FTO 靶向調(diào)控 ASB2 和 RARA 等抑制白血病細(xì)胞生長的基因,，通過去甲基化修飾后，導(dǎo)致靶 mRNA 穩(wěn)定性提高,，也相應(yīng)提高了蛋白質(zhì)含量,，這個結(jié)果與之前認(rèn)為的 m6A 導(dǎo)致 mRNA 穩(wěn)定性下降的結(jié)論出現(xiàn)了相反。另外通過沉默 m6A 的識別蛋白 YTHDF1 和 YTHDF2,，發(fā)現(xiàn)只有 YTHDF2 能影響到 ASB2 和 RARA 的 mRNA 水平,，但是對于這兩個蛋白的豐度卻沒有產(chǎn)生作用。提示還有新的調(diào)控機(jī)制尚待發(fā)現(xiàn),。

文章zui后提出了 FTO---ABS2/RARA 調(diào)控軸的機(jī)制模型：由于融合基因等因素的影響如 MLL-fusion 蛋白等刺激導(dǎo)致 FTO 表達(dá)上升,，降低靶基因如 ASB2，RARA 等的 mRNA m6A 修飾，抑制其功能發(fā)揮,，促進(jìn)了細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞分化,，并且抑制癌細(xì)胞對藥物的應(yīng)答。

圖 12. 機(jī)制模型

這項研究證實 m6A 修飾機(jī)制在白血病發(fā)育和藥物應(yīng)答過程中有重要作用,。靶向 FTO 信號途徑可能成為治療白血病的一個新的策略,。另外 FTO 也在其他一些實體瘤中發(fā)揮促癌作用，因此該研究結(jié)果可能對癌癥生物學(xué)研究和癌癥治療方法的開發(fā)有更廣泛的影響,。

參考文獻(xiàn)：

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