分子生物學是在生物化學基礎上發(fā)展起來的,，以研究核酸和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),、功能等生命本質(zhì)的學科,，在核酸,、蛋白質(zhì)分子水平研究發(fā)病,、診斷,、治療和預后的機制,。其中基因工程（基因技術(shù),，基因重組）是目前分子生物學研究熱點,，這些技術(shù)可以改造或擴增基因和基因產(chǎn)物，使微量的研究對象達到分析水平,，是研究基因調(diào)控和表達的方法,，也是分子水平研究疾病發(fā)生機制、基因診斷和基因治療的方法,。轉(zhuǎn)化（transformation）,、轉(zhuǎn)染,、轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)位等是自然界基因重組存在的方式,，也是人工基因重組常采用的手段,。基因重組的目的之一是基因克（gene clone）,，基因克隆可理解為以一分子基因為模板擴增得到的與模板分子結(jié)構(gòu)*相同的基因,。使需要分析研究的微量、混雜的目的基因易于純化,，得以增量,，便于分析?！　?/span>

     外來基因引起細胞生物性狀改變的過程叫轉(zhuǎn)化（transformation）,，以噬菌體把外源基因?qū)爰毦倪^程叫轉(zhuǎn)染（transfection）。利用載體（噬菌體或病毒）把遺傳物質(zhì)從一種宿主傳給另一種宿主的過程叫轉(zhuǎn)導（transduction）,。一個或一組基因從一處轉(zhuǎn)移到基因組另一處的過程叫轉(zhuǎn)位（transposition）,，這些游動的基因叫轉(zhuǎn)位子?！?/span>

   　一,、基因工程的常用工具　　

（一）載體　　

 載體（Vector）是把外源DNA（目的基因）導入宿主細胞，使之傳代,、擴增,、表達的工具。載體有質(zhì)粒（plasmid）,、噬菌體,、單鏈絲狀噬菌體和粘性末端質(zhì)粒（粘粒）、病毒等,。載體具有能自我復制,；有可選擇的，便于篩選,、鑒定的遺傳標記,；有供外源DNA插入的位點；本身體積小等特征,?！　?/span>

質(zhì)粒存在于多種細菌，是染色體（核）以外的獨立遺傳因子,，由雙鏈環(huán)狀DNA組成,，幾乎*裸露，很少有蛋白質(zhì)結(jié)合,。質(zhì)粒有嚴緊型和松弛型之分,。嚴緊型由DNA多聚酶Ⅲ復制,，一個細胞可復制1-5個質(zhì)粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ復制,，一個細胞可復制30-50個質(zhì)粒,，如果用氯霉素可阻止蛋白質(zhì)合成，使質(zhì)粒有效利用原料,，復制更多的質(zhì)粒,。質(zhì)粒經(jīng)過改造品種繁多，常用的有pBR322,、pUC系列等,。這些質(zhì)粒都含有多個基本基因,，如復制起動區(qū)（復制原點Ori）,，便于復制擴增；抗抗生素標記（抗氨芐青霉素Apr,、抗四環(huán)素Tcr等）或大腸埃希菌部分乳糖操縱子（E.coli LacZ）等,，便于基因重組體的篩選；基因發(fā)動子（乳糖操縱子Lac,、色氨酸操縱子Trp等）和轉(zhuǎn)錄終止序列,，便于插入的外源基因轉(zhuǎn)錄、翻譯表達,。質(zhì)粒上還有許多限制性內(nèi)切酶的切點,，即基因插入位點，又叫基因重組位點,，基因克隆位點,。　　

常用噬菌體載體有單鏈噬菌體M13系統(tǒng),；雙鏈噬菌體系統(tǒng),。噬菌體應和相應的宿主細胞配合使用。以上載體各有特點,，便于選擇,，靈活應用?！　?/span>

（二）工具酶　　

     工具酶是基因重組技術(shù)*的工具,。主要有限制性內(nèi)切酶、連接酶,、核酸聚合酶,、逆轉(zhuǎn)錄酶、核酸酶等,?！　∠拗菩詢?nèi)切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA內(nèi)切酶之分,，Ⅱ型能嚴格識別核酸序列，并在識別區(qū)內(nèi)特定的核苷酸處切開DNA雙鏈,。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA內(nèi)切酶,。識別分四核苷酸和六核苷酸，其序列旋轉(zhuǎn)對稱,。切口分開端和粘端,，產(chǎn)生3′－OH和5′－P末端。內(nèi)切酶品種多,，使用時應注意溫度,、緩沖液用量（一般1μg DNA/2-5單位酶）等反應條件。
酶識別序列切口

 Alu Ⅰ…AGCT……AG CT…四核苷酸 

  …TCGA……TC GA…平端切口Eco 

  R1…GAATTC……G AATTC…六核苷酸 

  …CTTAAG……CTTAA G…粘端切口
　　連接酶有T4噬菌體DNA連接酶,、T4噬菌體RNA連接酶,、大腸埃希菌DNA連接酶等。DNA連接酶可連接平端,，也連接粘端,。反應需有Mg2+和ATP存在，pH7.5-7.6,。zui適溫度37℃,，30℃以下活性明顯下降，但考慮到被連接DNa 的穩(wěn)定性和粘性末端的退火溫度,，一般平端連接用20-25℃,，粘端連接用12℃左右?！　?/span>    

聚合酶有DNA聚合酶（以DNA為模板合成DNA大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ,，大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow大片段），T4或T7噬菌體DNA聚合酶等）,；RNA聚合酶（以DNA為模板合成RNA,，T7或T3噬菌體RNA聚合酶）；逆轉(zhuǎn)錄酶（以RNA為模板合成DNA,，除RNA病毒中發(fā)現(xiàn)外,，發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶都有逆轉(zhuǎn)錄活性）?！　?/span>

大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′,，3′→5′外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ被枯草桿菌酶作用產(chǎn)生的一個大片段,，有5′→3′聚合酶和5′→3′外切酶活性,，無3′→5′外切酶活性。可用于缺口翻譯（Nick translation）法標記核酸,，也可用于DNA序列測定,，修補DNA鏈等?！　?/span>

核酸酶有DNase,、RNase、核酸酶S1等,，可水解相應的DNA和RNA,，核酸酶S1可降解單鏈DNA和RNA，用量增大也可降解雙鏈核酸,。它可用于切去ds-cDNA合成中產(chǎn)生的發(fā)夾環(huán),。　　末端轉(zhuǎn)移酶在Mg2+存在下,，選擇3′－OH端單鏈DNA為引物加成核苷酸,，在Co2+存在下，選擇3′－OH端雙鏈DNA為引物加成核苷酸,，形成多聚核苷酸尾,。常用于核酸末端標記和核酸連接的互補多聚尾（連接器）,。　　堿性磷酸酶去除5′－P,，可防止二分子DNA片段5′端P基團自身空間障礙,，影響DNA分子之間的連接，一般用堿性磷酸酶處理載體DNA除去5′端P基團,，在連接酶作用下目的基因的5′端P先與載體3′端OH連接,，再通過復制修復另一條鏈，使二　　

二,、目　的　基　因　　

常把需研究的基因稱為目的基因,，需分析的基因稱靶基因，在基因克隆過程中有時兩者均稱為插入基因,，有時三者含義相近,。簡單的原核生物目的基因可從細胞核中直接分離得到，但人類的基因分布在23對染色體上,，較難從直接法得到,。簡短的目的基因可在了解一級結(jié)構(gòu)或通過了解多肽鏈一級結(jié)構(gòu)氨基酸編碼的核苷酸序列基礎上人工合成。但多數(shù)的目的基因由mRNA合成cDNA（complementary DNA,，反轉(zhuǎn)錄DNA）得到,。CDNA通過各種方式與載體連接，克隆可得到全長cDNA或片段，用于探針制備,、序列分析,、基因表達等研究。因此以cDNA為研究材料反映了mRNA的轉(zhuǎn)錄及對以后翻譯的影響情況,，即反映某一基因（DNA）外顯子的情況,。　

    三、基因庫的建立　　建立基因庫的目的是為了便于目的基因的保存,、擴增和純化,。基因庫是利用工具酶,，通過基因重組技術(shù)和轉(zhuǎn)化,、篩選而建立，也是基因克隆的過程,。實際上是利用低等生物如細菌,、病毒、噬菌體等生長快,，繁殖力強的特點,，而作為一種核酸擴增篩選的載體，把人類等高等生物的基因或其片段用工具酶插入,，重組于其中,，經(jīng)篩選，克隆得到目的基因與載體重組的重組基因,，成為便于保存,，取用方便的基因庫?；驇旖涣魇茄芯渴抑g交流目的基因的常用方式,。　　

（一）基因重組　　基因重組方案很多,，簡單的可用同一種限制性內(nèi)切酶分別在載體和目的基因切出相對應的切口,，便于連接。也可用末端連接酶合成連接器（圖18-3）,。近年,，Okayama方案為實驗室普遍采用，該方法可得到全長的cDNA,?！　。ǘ┺D(zhuǎn)化　　轉(zhuǎn)化目的是把有復制能力,，但在細胞外無復制活性的目的基因-載體重組體裝入細胞（大腸埃希菌）,，使目的基因隨載體在細胞內(nèi)復制、擴增。實驗步驟介紹如下：

基因重組方案之一　　

⒈大腸埃希菌的處理（增加細胞膜通透性,，便于基因進入細胞）大腸埃希菌（E.Coli cells）接種于Lb agar培養(yǎng)基,，37℃培養(yǎng)一晚。挑選3~5個大菌落,，接種于50ml LB培養(yǎng)基,，37℃，振搖培養(yǎng)一晚后,，在A550測定,，要求細菌繁殖一定量（一般為細菌對數(shù)生長期），野生型（rec＋,，5x107cells/ml）為0.2-0.3,，缺陷型（rec-，5x107cells/ml）為0.5-0.6,。離心棄去上清液,，用20ml，50mmol/L,，CaCl2懸浮菌體,。冰浴20分鐘，低溫離心,。棄上清液,，用2.5ml冰50mmol/l CaCl2懸浮。4℃可保存48小時,，用于轉(zhuǎn)化,，稱competent cells?！　、操|(zhì)粒（如經(jīng)基因重組建立的重組質(zhì)粒,，基因庫等）的轉(zhuǎn)化 將competent cells（以美國BRL公司DH10B菌株為例）置冰水浴,。同時將Falcon2059（傳熱系數(shù)穩(wěn)定）塑料試管置冰水浴。取100μl菌液（DH10B）于2059試管中,，加10倍稀釋的巰基乙醇1μl,，冰浴輕搖2分鐘，放置10分鐘,。取0.1-50ng質(zhì)粒加入試管,，輕輕搖勻，冰浴30分鐘,。此間備好42℃水浴,。并將SOC培養(yǎng)基置42℃?zhèn)溆谩⒃嚬苤糜?2℃，輕搖45秒鐘,，馬上置冰浴2分鐘,。使competent cells熱脹冷縮，把質(zhì)粒導入菌體,。加42℃SOC培養(yǎng)基0.9ml于試管,，37℃培養(yǎng)1小時。1000rpm離心10分鐘,，棄上清液,，用200μlSOC培養(yǎng)基懸浮菌體。接種于LB-氨芐青霉素（100U/ml）培養(yǎng)皿,，37℃培養(yǎng)一晚,。已轉(zhuǎn)化的菌體可形成菌落（因質(zhì)粒上有抗氨芐青霉素基因）。在了解目的基因或其產(chǎn)物的基礎上對菌落進行鑒定,。并在LB培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng),。基因庫的建立,、轉(zhuǎn)化,、篩選、擴增,、純化的過程就是基因克隆的過程,。　　LB培養(yǎng)基（1L）：10g蛋白胨,，5g酵母膏,，10g NaCl，高壓滅菌,，pH7.5,。　　SOB培養(yǎng)基（1L）：20g蛋白胨,，5g酵母膏,，0.5g NaCl，高壓滅菌,。另外準備2mol/L鎂溶液（1mol/L氯化鎂與1mol/L硫酸鎂等量混勻,，過濾滅菌），臨用前加1ml于100ml培養(yǎng)基,?！　OC培養(yǎng)基（100ml）：臨用前加入1ml過濾滅菌的2mol/L葡萄糖?！　?/span>

四,、核酸的分離與純化　　核酸存在于多種細胞,，如病毒、細菌,、寄生蟲,、動植物細胞；多種標本中,，如血液,、組織、唾液,、尿液等其它來源的標本,。因此分離方法復雜而多樣。又因各種DNA,、RNA的豐度差異,，各種分析方法對核酸的純度與量的要求有差異，因此在實驗前應對采用的方法有所了解和選擇,?？偟恼f來核酸的分離與純化是在溶解細胞的基礎上，利用苯酚等有機溶劑抽提（核酸溶于緩沖液,，即水相）,，分離，純化,；乙醇,、丙酮等有機溶劑沉淀，收獲,。溶解細胞的方法因標本不同而不同,，有用SDS加NaOH，有用蛋白酶,，有的用超聲波破碎等方法,，苯酚提取主要使蛋白質(zhì)變性沉淀于有機相，而核酸保留在水相,，達到分離核酸的目的,。實驗上生物標本中含量zui多的就是蛋白質(zhì)。為了除去分離過程中殘留的有機溶劑,，常用的方法是加冷乙醇和鹽沉淀核酸，通過離心回收核酸,，然后用70％-80％乙醇洗滌沉淀,，除去多余的鹽，以免影響核酸溶解和抑制后續(xù)步驟的酶促反應,。為了得到純的核酸可用蛋白酶除去蛋白,，用RNA酶除去RNA,，得到純的DNA，用DNA酶除去DNA而獲得RNA,。目前開發(fā)了許多商品化的核酸分離柱,，可簡單、快速地分離得到純度很高的DNA或RNA,。其分離原理有的利用核酸的分子量差異,，有的利用需分離核酸的特點與其特異性結(jié)合達到分離、回收的目的,?！　。ㄒ唬┵|(zhì)粒的分離與純化　　含質(zhì)粒的E. Coli cells經(jīng)LB培養(yǎng)液250ml擴大培養(yǎng),，倒入50ml離心管,，4℃，3000rpm,，離心15分鐘,。棄去上清液。（棄去液丟棄前應作消毒處理,，以免污染環(huán)境）,。加lysis buffer(50mmol/L Glucose，10mmol/l EDTA,，25mmol/l Tris-HCl,，pH8.0)1-2ml使之懸浮。放置室溫5分鐘,，加3.5-7ml新配制SDS/NaOH溶液（1mol/l NaOH 8ml,，20％SDs 2ml，蒸餾水30ml）上下?lián)u勻,，置冰水浴5分鐘,。禁用混勻器，以免DNA分子斷裂）,，加2.5mol/L醋酸鉀緩沖液（pH4.8）2.6-5.2ml,，上下?lián)u勻，冰浴5分鐘,。4℃,，3000rpm，離心15分鐘,。沉淀蛋白質(zhì),。取上清液，加無水乙醇12-24ml（上清液的二倍）放室溫15分鐘后,，10000rpm離心,，棄上清液,。加約為沉淀物體積的0.4倍TE（10mmol/l Tris-Hcl pH8.0，10mmol/l EDTA）溶解沉淀后,，加0.2倍的7.5mol/L醋酸銨,。可用混勻器混勻,，置冰浴10分鐘,。4℃，10000rpm離心5min,，棄上清液,。加沉淀物0.4倍的10mmol/l Tris-HCl pH7.5，10mmol/l EDTA緩沖液,，1/10體積的5mg/ml RNase,，37℃，30分鐘保溫,。加等量的phenol（酚）/CIAA(480ml,，20ml異戊醇)，混勻,。4℃,，10000rpm，離心5分鐘,。取上層液加酚/CIAA重復一次,。取上層液加1/10體積5mol/l NaCl和2倍無水乙醇，―20℃過夜或―70℃2小時以上,。4℃,，10000rpm，離心10分鐘,，棄上清液,。加80％乙醇不搖動，直接10000rpm離心,，棄上清液,，真空干燥。加適量（約200μl）TE溶解,。測定含量后備用,。　?。ǘ┲亟M質(zhì)粒中目的基因的分離與純化　　先取少量純化的重組質(zhì)粒,，用限制性內(nèi)切酶切出目的基因，經(jīng)電泳分離,，確認,。以200μl含2mg DNA（重組質(zhì)粒）為例：取10μl含100μg DNA，加90μl TE,。按1μg DNA加2-5U限制性內(nèi)切酶,，1/10體積緩沖液，1-2小時保溫,。緩沖液種類和酶反應溫度因內(nèi)切酶種類而異,。1/10體積3mol/l NaAc，2倍無水乙醇,，－70℃,，2小時（－20℃過夜），10000rpm,，10分鐘離心,，棄上清液（乙醇沉淀）。適量TE溶解沉淀（切斷的DNA質(zhì)粒與目的基因混合物）,，電泳分離（用相應分子量DNA標準同時電泳）,，在紫外光下觀察結(jié)果，與標準DNA分子量比較,，確認目的基因和內(nèi)切酶的切割效果,。　　

⒈電泳條件：
凝膠制備：1％瓊脂糖凝膠agarose(mg)X50TAE(ml)EB(溴化乙錠μl)