離體蛙心灌流 
 一、【目的要求】   1、學(xué)習(xí)斯氏離體蛙心灌流法; 2,、了解心肌的生理特性;   3、觀察Na+,K+,Ca2+及腎上腺素(Adr),乙酰膽堿(ACh)等對離體心臟活動的影響,。  
 二,、【原理】        將離體蛙心（失去神經(jīng)支配的蛙心）保持在適宜的環(huán)境中，在一定的時間內(nèi)仍然能夠保持節(jié)律性收縮,，心臟正常的節(jié)律性活動需要一個適宜的理化環(huán)境,，離體心臟也是如此，離體心臟脫離了機體的神經(jīng)支配和全身體液因素的直接影響,，可以通過改變灌流液的某些成分,，觀察其對心臟活動的作用。心肌細(xì)胞的自律性,、興奮性,、傳導(dǎo)性及收縮性，都與鈉,、鉀及鈣等離子有關(guān)。血鉀濃度過高時（高于7.9mmol/L）,，心臟興奮性,、自律性、傳導(dǎo)性及收縮性都下降,，表現(xiàn)為收縮力減弱,、心動過緩和傳導(dǎo)阻滯，嚴(yán)重時心臟可停搏于舒張期,。血鈣濃度升高時,，心臟收縮力增強，過高可使心室停搏于收縮期,。血鈣濃度降低,，心肌收縮力減弱。血中鈉離子濃度的輕微變化,，對心肌影響不明顯,，只有發(fā)生明顯變化時，才會影響心肌的生理特性,。腎上腺素可使心率加快,、傳導(dǎo)加快及心肌收縮力增強，乙酰膽堿則與腎上腺素的作用相反,。  
三,、【實驗儀器】   青蛙、 常用手術(shù)器械、蛙板(或蠟盤),、蛙心夾,、計算機采集系統(tǒng)、張力傳感器,、支架,、雙凹夾、雙針形露絲刺激電極,、滴管,、培養(yǎng)皿(或小燒杯)、紗布,、棉線,、橡皮泥、任氏液,。蛙心套管(斯氏套管或八木氏套管),、套管夾、0．65％NaCl,、5％NaCI,、2％CaCl2、1％KCl,、1：5 000腎上腺素,、1：10 000乙酰肌堿、300U／mL肝素,。   
    四,、【方法與步驟】  1、斯氏蛙心插管法   （1）一只青蛙,，雙毀髓后背位置于蠟盤中,，按前面的方法暴露心臟。仔細(xì)識別心臟周圍的大血管(見右圖),。在左主動脈下方穿一線,，于動脈圓錐處結(jié)扎(動物個體小時，結(jié)扎位置可靠上些),。再從左右兩主動脈下方穿一線,，并打一活結(jié)備用。左手提起主動脈上的結(jié)扎線,，右手用眼科剪在結(jié)扎線下方,、沿向心方向?qū)用}上壁剪一斜口。選擇大小適宜的蛙心套管,，然后將盛有少量(套管內(nèi)2～3 cm高度)任氏液(內(nèi)加入一滴肝素溶液)的斯氏蛙心套管,，山開口處插入動脈圓錐(見右圖),。當(dāng)套管到達動脈圓錐基部時，應(yīng)將套管稍稍后退,，使向動脈圓錐的背部后下方及心尖方向推進,，經(jīng)主動脈瓣插入心室腔內(nèi)(于心室收縮時插入，但不可插得過深,，以免心室壁堵住套管下口),。此時可見套管中血液沖人套管，并使液面隨心臟搏動而亡下移動,，表明操作成功(否則需退回并重新插入),。用滴管吸去套管中的血液，更換新鮮任氏液,。穩(wěn)定住套管后,，輕輕提起備用線，將左,、右主動脈連同插入的套管用雙結(jié)扎緊(不得漏液),，再將結(jié)線固定在套管的小玻璃鉤上，然后剪斷結(jié)扎線上方的血管,。輕輕提起套管和心臟,，看清靜脈竇的位置，于靜脈竇下方剪斷有牽連的組織,，僅保留靜脈竇與心臟的,，使心臟離體(切勿損傷靜脈竇)。用任氏液反復(fù)沖洗心室內(nèi)余血,，使套管內(nèi)灌流液不再有殘留血液。保持套管內(nèi)液面高度一致(1.5～2 cm),，即可進行實驗,。   （2）將插好離體心臟的套管固定在支架上，用蛙心夾夾住少許心尖部肌肉 (不可夾得過多,，以免因夾破心室而漏液),。再將蛙心夾上的系線繞過一個滑輪與張力傳感器相連（如右圖）。注意：勿使灌流液滴到傳感器上,。調(diào)節(jié)顯示器上心臟收縮曲線的幅度適中,。  
2、 實驗觀察   (1)記錄正常心搏曲線   (2)改用0．65％NaCI溶液灌流,，并作好加藥標(biāo)記,，觀察心搏變化。待曲線 氏插管裝置出現(xiàn)明顯變化時,，立即吸去套管中的灌流液,，同時做好沖洗標(biāo)記,，并用新鮮任氏液清洗2—3次，待心搏恢復(fù)正常,。注意：換液時切勿碰套管,，以免影響描記曲線的基線，同時保持灌流液面一致(以下同),。 觀察可得,，NaCI溶液會阻遏心臟搏動。   (3) 迅速用新鮮任氏液清洗2～3次,，待心搏恢復(fù)正常,。向套管內(nèi)加入1～3滴2％CaCI：溶液，觀察并記錄心搏曲線的變化,。當(dāng)出現(xiàn)明顯變化時,，立即更換任氏液，待心搏恢復(fù)正常(如果恢復(fù)遲緩,，可多次沖洗),。   (4)同法向套管中加1—2滴1％KCl溶液，記錄心搏曲線的變化,。當(dāng)心搏曲線變化時,，同法更換灌流液，待心搏恢復(fù)正常,。   (5)同法記錄套管中加入l～2滴的腎上腺素溶液(1：10 000)后心搏曲線的變化,。  (6)同法記錄套管中加入1—2滴乙酰膽堿溶液(1：10 000)后心搏曲線的變化。
分析：滴加Na離子溶液后,，心跳減弱,，這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因是由于灌注液中缺乏Ca2+，當(dāng)Na＋明顯增高時,，膜內(nèi)外鈉離子的濃度梯度增大,，因此，細(xì)胞Na離子內(nèi)流加快,，去極速
度和幅度均增加,，導(dǎo)致傳導(dǎo)性和自律性增高。同時,，Na離子內(nèi)流的增多促進細(xì)胞內(nèi)Ca2＋
的
外運使細(xì)胞內(nèi)Ca2＋
濃度降低,，因此，心肌收縮能力減弱,。 
 
3,、 滴加2%CaCl溶液 分析：細(xì)胞外Ca2＋在細(xì)胞膜上對Na＋內(nèi)流有競爭性抑制作用，稱為膜屏障作用,。[Ca2＋]  增高時,，Na＋內(nèi)流受抑制,，細(xì)胞0期除極速度與幅度減小，使興奮性及傳導(dǎo)性均降低,。[Ca2 ＋] 增高使Ca2＋內(nèi)流增多,，因此慢反應(yīng)細(xì)胞0期去極化加快加強，傳導(dǎo)性增高,，而快反應(yīng)細(xì)胞平臺期縮短,，有效不應(yīng)期縮短，復(fù)極加速,。Ca2＋內(nèi)流增多,，使心肌收縮能力增強。[Ca2＋ ] 降低時,，所引起的變化與高鈣時相反,。因此加入CaCl2后，心率減少,、振幅減少,，基線上移。
4,、滴加1%KCl溶液分析：滴加1％KCl后的心搏曲線,，曲線的頻率逐漸減小，愈來愈疏,，幅度逐漸下降,，zui后停止在基線處，即心臟停博于舒張狀態(tài),。因為當(dāng)細(xì)胞K+濃度增高時,，K+與Ca2+有競爭性拮抗作用，K+抑制細(xì)胞膜對Ca2+的轉(zhuǎn)運,，使進入細(xì)胞內(nèi)Ca2+減少,，心肌的興奮—收縮偶聯(lián)過程減弱，心肌收縮力降低,。所以心搏曲線振幅減小。 
5,、 滴加1：10000腎上腺素溶液分析：滴加腎上腺素后,，蛙心收縮增強，心臟舒張*,，描記的心搏曲線幅度明顯增大,。其作用機理是，腎上腺素可與心肌細(xì)胞膜上的B受體結(jié)合,，提高心肌細(xì)胞和肌漿網(wǎng)膜Ca2+通透性,，導(dǎo)致肌漿中Ca2+濃度增高,，使心肌收縮增強。另外,，腎上腺素還有降低肌鈣蛋白與Ca2+親和力,，促使肌鈣蛋白對Ca2+的釋放速率增加，提高肌漿網(wǎng)膜攝取Ca2+的速度,，刺激Na+與Ca2+交換,，使復(fù)極期向細(xì)胞外排出Ca2+的作用加速，這樣,，將使心肌舒張速度增快,，整個舒張過程明顯增強。  
 6,、 滴加1：10000乙酰膽堿溶液分析：上圖可示,，蛙心收縮減弱，心率減慢,，zui后出現(xiàn)蛙心停止舒張階段,。其機理為：乙酰膽堿與心肌細(xì)胞膜M受體結(jié)合，一方面提高心肌細(xì)胞膜K+通道的通透性,，促使K+外流,，將引起：1）竇房強細(xì)胞復(fù)極時K+外流增多，zui大復(fù)極電位值增大,；Ik衰減過程減弱,，自動除極速度減慢。這兩方面因素導(dǎo)致竇房自律性降低,，心率減慢,。2）復(fù)極過程中K+外流增加，動作電位2,、3期縮短,，Ca2+進入細(xì)胞內(nèi)減少，使心肌收縮減弱,；另一方面乙酰膽堿可直接抑制Ca2+通道,，減少Ca2+內(nèi)流，進而使心肌收縮減弱,。