一,、四唑鹽(MTT)比色法:
檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法除前面所介紹的方法外,,還可用四唑鹽比色法試驗(yàn)(MTT)。此法的原理是:活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物,,并沉積在細(xì)胞中,,而細(xì)胞無(wú)此功能,。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的藍(lán)紫色結(jié)晶物,用酶聯(lián)免疫檢測(cè),,以在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值,,可間接反應(yīng)活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi),,MTT結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比,。
●0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞使其成為單細(xì)胞,用含0.1%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基配成1 x10^9個(gè)/L的但細(xì)胞懸液,,將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中,,每孔100ul。
●將培養(yǎng)板置CO2培養(yǎng)箱中,,在37℃,、5%CO2條件下,培養(yǎng)3-5天,。
●培養(yǎng)3-5天后,,每孔加入MTT溶液10ul,繼續(xù)置培養(yǎng)箱孵育3-6h,,終止培養(yǎng),,加10%SDS-HCl 100ul/孔,37℃培養(yǎng)數(shù)小時(shí),,將細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞周?chē)腗TT顆粒充分溶解,。
●用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定每孔吸光度(OD),選波長(zhǎng)490nm,。以時(shí)間為橫軸,,OD值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
用此法測(cè)細(xì)胞活力,,為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性,,在試驗(yàn)前測(cè)定每種細(xì)胞的貼比率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長(zhǎng)曲線,,再確定每孔細(xì)胞接種數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間,,以保證培養(yǎng)終止時(shí)不會(huì)過(guò)滿。另外,,實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)空白對(duì)照,,比色時(shí),以空白孔調(diào)零,。
二、細(xì)胞蛋白質(zhì)含量測(cè)定法(考馬斯亮藍(lán)測(cè)定法):
基本原理為:考馬斯亮藍(lán)在酸性溶液與蛋白質(zhì)結(jié)合,,在595nm波長(zhǎng)處呈zui大吸收,,其OD值與蛋白質(zhì)含量成正比。主要用于測(cè)定妹、受體及細(xì)胞外代謝物的特異性活性,。
●用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,,制成懸液,用含10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/ml,,接種24孔培養(yǎng)板,,每孔1ml,置37℃,、5%CO2條件下培養(yǎng)一段時(shí)間,。
●用胰蛋白酶消化分散,培養(yǎng)板的細(xì)胞懸浮在PBS中,,細(xì)胞計(jì)數(shù),,取106細(xì)胞以1000r/min離心5min,棄上清,,加0.5 ml 0.1%SDS或0.3mol/LNaOH,,置100℃煮3min,使細(xì)胞裂解,。
●取0.1考馬斯亮藍(lán)染液與100ul上述細(xì)胞裂解液混勻,,放置10min,。
●用可見(jiàn)光分光光度計(jì)在595nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的OD值。以溶劑為空白對(duì)照,以已知量的牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后根據(jù)曲線推算樣品中蛋白質(zhì)含量,。
三,、細(xì)胞蛋白質(zhì)合成測(cè)定法(3H-亮氨酸摻入法):
基本原理為:細(xì)胞在合成蛋白質(zhì)時(shí)需要攝取外源性氨基酸,用同位素標(biāo)記氨基酸如3H-亮氨酸可以摻入細(xì)胞蛋白合成代謝中,,通過(guò)測(cè)定細(xì)胞的放射性強(qiáng)度,,可了解細(xì)胞蛋白質(zhì)合成代謝情況。
●取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,,用0.25%胰蛋白酶消化,,懸浮于含10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中,調(diào)整細(xì)胞密度107-109個(gè)/L,,接種于24孔培養(yǎng)板,,每孔1ml。
●將培養(yǎng)板置37℃,、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),,每孔100ul預(yù)溫37℃的3H-亮氨酸。
●繼續(xù)培養(yǎng)4-24h,。
●終止培養(yǎng),,取出培養(yǎng)板,,小心吸取培養(yǎng)上清,用預(yù)冷的PBS洗滌,,晾干,。如果細(xì)胞松散,可先用甲醇固定10min,。
●把培養(yǎng)板放在冰蓋上,,每孔加1ml 10%三氯醋酸(TCA),在4℃放置10min,,吸取上清,。
●甲醇洗滌、晾干,。
●每孔加0.5ml 10.3 mol/L NaOH,,1%SDS,室溫下放置30min,。
●混勻,,移入閃爍液,用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定每分鐘脈沖數(shù)(cpm),,以cpm/106細(xì)胞或cpm/mg蛋白表示,。
四,、細(xì)胞DNA合成測(cè)定法:
1,、3H-TdR摻入法
基本原理為:胸腺嘧啶核苷(TdR)是DNA*的堿基,也是DNA合成的必需物質(zhì),。用同位素3H標(biāo)記即3H-TdR作為DNA合成的前體摻入DNA合成代謝過(guò)程中,,通過(guò)測(cè)定細(xì)胞的放射性強(qiáng)度,可以反映細(xì)胞DNA的代謝及細(xì)胞增殖情況,。
(一)方法一
●取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,,制成3 X 10^8個(gè)/L的細(xì)胞懸液,接種于24孔培養(yǎng)板中,,每孔1ml,。
●將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h左右,。
●在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),,每孔加入100ul3H-TdR(用HBSS)配制,3.7 X 10^8 Bp/L過(guò)濾除菌,,使終濃度為3.7 X 10^7 Bp/L,。
●繼續(xù)培養(yǎng)1-24h。
●終止培養(yǎng),,小心吸棄上清,,用HBSS漂洗單層細(xì)胞2次,,然后加入2mo預(yù)冷的10%TCA,放置10min,。如果細(xì)胞松散,應(yīng)先用固定甲醇10min,,用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定每分鐘脈沖數(shù),,結(jié)果以cpm/10^6細(xì)胞表示。
(二)方法二
●同方法一*步,。
●將培養(yǎng)板放入37℃,、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)56h左右。
●每孔加入100ul 3H-TdR,。
●繼續(xù)培養(yǎng)16h,。
●終止培養(yǎng),將細(xì)胞收集于49型濾膜上,,如為貼壁細(xì)胞,,吸棄培養(yǎng)上清后,用0.25%胰蛋白酶消化2-5min,;如為血細(xì)胞,,先用蒸餾水破紅細(xì)胞。然后再收集細(xì)胞,,收集后要加10%CTA和甲醇固定,。
●將濾膜烘干后移入已知有3min閃爍液的閃爍瓶中,在液體閃爍計(jì)數(shù)儀上測(cè)定每分鐘脈沖數(shù)或衰變數(shù),,結(jié)果以cpm/10^6細(xì)胞或dpm/10^6細(xì)胞表示,。
2、流式細(xì)胞儀測(cè)定DNA合成
用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞增殖周期和DNA合成是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的新手段,,不僅快速,、準(zhǔn)確、效果好,,而且消除了同位素標(biāo)記的許多繁瑣方法和放射性污染,。
●取80%匯合至接近*匯合的細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,,制備成單細(xì)胞懸液,,細(xì)胞密度1想0^9個(gè)/L,注意不要留有細(xì)胞碎片,。
進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè),。除檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相變化和反應(yīng)DNA合成外,還可了解染色體倍性,;結(jié)合熒光免疫法,,還可對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行分析等,。
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