一,、四唑鹽（MTT）比色法：

檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法除前面所介紹的方法外,，還可用四唑鹽比色法試驗(yàn)（MTT）。此法的原理是：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物,，并沉積在細(xì)胞中,，而細(xì)胞無(wú)此功能,。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的藍(lán)紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測(cè),，以在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值,，可間接反應(yīng)活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi),，MTT結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比,。

●0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞使其成為單細(xì)胞，用含0.1%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基配成1 x10^9個(gè)/L的但細(xì)胞懸液,，將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中,，每孔100ul。

●將培養(yǎng)板置CO2培養(yǎng)箱中,，在37℃,、5%CO2條件下，培養(yǎng)3-5天,。

●培養(yǎng)3-5天后,，每孔加入MTT溶液10ul，繼續(xù)置培養(yǎng)箱孵育3-6h,，終止培養(yǎng),，加10%SDS-HCl 100ul/孔，37℃培養(yǎng)數(shù)小時(shí),，將細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞周?chē)腗TT顆粒充分溶解,。

●用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定每孔吸光度（OD），選波長(zhǎng)490nm,。以時(shí)間為橫軸,，OD值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

用此法測(cè)細(xì)胞活力,，為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性,，在試驗(yàn)前測(cè)定每種細(xì)胞的貼比率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長(zhǎng)曲線,，再確定每孔細(xì)胞接種數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間,，以保證培養(yǎng)終止時(shí)不會(huì)過(guò)滿。另外,，實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)空白對(duì)照,，比色時(shí)，以空白孔調(diào)零,。

二、細(xì)胞蛋白質(zhì)含量測(cè)定法（考馬斯亮藍(lán)測(cè)定法）：

基本原理為：考馬斯亮藍(lán)在酸性溶液與蛋白質(zhì)結(jié)合,，在595nm波長(zhǎng)處呈zui大吸收,，其OD值與蛋白質(zhì)含量成正比。主要用于測(cè)定妹、受體及細(xì)胞外代謝物的特異性活性,。

●用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,，制成懸液，用含10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10⁴個(gè)/ml,，接種24孔培養(yǎng)板,，每孔1ml，置37℃,、5%CO₂條件下培養(yǎng)一段時(shí)間,。

●用胰蛋白酶消化分散，培養(yǎng)板的細(xì)胞懸浮在PBS中,，細(xì)胞計(jì)數(shù),，取10⁶細(xì)胞以1000r/min離心5min，棄上清,，加0.5 ml 0.1%SDS或0.3mol/LNaOH,，置100℃煮3min，使細(xì)胞裂解,。

●取0.1考馬斯亮藍(lán)染液與100ul上述細(xì)胞裂解液混勻,，放置10min,。

●用可見(jiàn)光分光光度計(jì)在595nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的OD值。以溶劑為空白對(duì)照，以已知量的牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后根據(jù)曲線推算樣品中蛋白質(zhì)含量,。

三,、細(xì)胞蛋白質(zhì)合成測(cè)定法（³H-亮氨酸摻入法）：

基本原理為：細(xì)胞在合成蛋白質(zhì)時(shí)需要攝取外源性氨基酸，用同位素標(biāo)記氨基酸如³H-亮氨酸可以摻入細(xì)胞蛋白合成代謝中,，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞的放射性強(qiáng)度,，可了解細(xì)胞蛋白質(zhì)合成代謝情況。

●取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,，用0.25%胰蛋白酶消化,，懸浮于含10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度10⁷-10⁹個(gè)/L,，接種于24孔培養(yǎng)板,，每孔1ml。

●將培養(yǎng)板置37℃,、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),，每孔100ul預(yù)溫37℃的³H-亮氨酸。

●繼續(xù)培養(yǎng)4-24h,。

●終止培養(yǎng),，取出培養(yǎng)板,，小心吸取培養(yǎng)上清，用預(yù)冷的PBS洗滌,，晾干,。如果細(xì)胞松散，可先用甲醇固定10min,。

●把培養(yǎng)板放在冰蓋上,，每孔加1ml 10%三氯醋酸（TCA），在4℃放置10min,，吸取上清,。

●甲醇洗滌、晾干,。

●每孔加0.5ml 10.3 mol/L NaOH,，1%SDS，室溫下放置30min,。

●混勻,，移入閃爍液，用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定每分鐘脈沖數(shù)（cpm）,，以cpm/10⁶細(xì)胞或cpm/mg蛋白表示,。

四,、細(xì)胞DNA合成測(cè)定法：

1,、³H-TdR摻入法

基本原理為：胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA*的堿基，也是DNA合成的必需物質(zhì),。用同位素³H標(biāo)記即³H-TdR作為DNA合成的前體摻入DNA合成代謝過(guò)程中,，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞的放射性強(qiáng)度，可以反映細(xì)胞DNA的代謝及細(xì)胞增殖情況,。

（一）方法一

●取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,，制成3 X 10^8個(gè)/L的細(xì)胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板中,，每孔1ml,。

●將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h左右,。

●在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),，每孔加入100ul³H-TdR（用HBSS）配制，3.7 X 10^8 Bp/L過(guò)濾除菌,，使終濃度為3.7 X 10^7 Bp/L,。

●繼續(xù)培養(yǎng)1-24h。

●終止培養(yǎng),，小心吸棄上清,，用HBSS漂洗單層細(xì)胞2次,，然后加入2mo預(yù)冷的10%TCA，放置10min,。如果細(xì)胞松散，應(yīng)先用固定甲醇10min,，用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定每分鐘脈沖數(shù),，結(jié)果以cpm/10^6細(xì)胞表示。

（二）方法二

●同方法一*步,。

●將培養(yǎng)板放入37℃,、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)56h左右。

●每孔加入100ul ³H-TdR,。

●繼續(xù)培養(yǎng)16h,。

●終止培養(yǎng)，將細(xì)胞收集于49型濾膜上,，如為貼壁細(xì)胞,，吸棄培養(yǎng)上清后，用0.25%胰蛋白酶消化2-5min,；如為血細(xì)胞,，先用蒸餾水破紅細(xì)胞。然后再收集細(xì)胞,，收集后要加10%CTA和甲醇固定,。

●將濾膜烘干后移入已知有3min閃爍液的閃爍瓶中，在液體閃爍計(jì)數(shù)儀上測(cè)定每分鐘脈沖數(shù)或衰變數(shù),，結(jié)果以cpm/10^6細(xì)胞或dpm/10^6細(xì)胞表示,。

2、流式細(xì)胞儀測(cè)定DNA合成

用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞增殖周期和DNA合成是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的新手段,，不僅快速,、準(zhǔn)確、效果好,，而且消除了同位素標(biāo)記的許多繁瑣方法和放射性污染,。

●取80%匯合至接近*匯合的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,，制備成單細(xì)胞懸液,，細(xì)胞密度1想0^9個(gè)/L，注意不要留有細(xì)胞碎片,。

進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè),。除檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相變化和反應(yīng)DNA合成外，還可了解染色體倍性,；結(jié)合熒光免疫法,，還可對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行分析等,。