組織細(xì)胞的破碎方法很多,,有機械方法,、物理方法、化學(xué)方法和生物化學(xué)方法等,。在破碎前,材料常需要預(yù)處理,,如動物材料要除去與實驗無關(guān)甚至有妨礙的結(jié)締組織,,脂肪組織和血污等,植物種子需要除殼,,微生物材料需將菌體和發(fā)酵液成分分開等。
不同實驗規(guī)模,、不同實驗材料和實驗要求,使用的破碎方法和條件也不同,。一些堅韌組織,如肌肉,、植物的根莖等,常需要強烈的攪拌或研磨作用,,才能把其組織細(xì)胞破壞。而比較柔軟的組織如肝,、腦等,用普通的玻璃勻漿器即可達(dá)到*破壞細(xì)胞的目的,。對同一實驗材料,由于實驗?zāi)康模ㄒ螅┑牟煌?,采用的破碎方式也存在一定差異,如提取中的核酸和提取其中的核苷酸,,前者必須保持十分溫和的條件,以保持分子的完整性,;后者可采用強烈手段,。
1、機械法
主要通過機械切力的作用使組織細(xì)胞破碎的方法,,常用的器械有組織搗碎機、勻漿器,、研缽和研磨,、壓榨器等,。
1)組織搗碎機
一般用于動物組織,、植物肉質(zhì)種子,、柔嫩的葉芽等,轉(zhuǎn)速可高達(dá)10000rpm/M以上,。由于旋轉(zhuǎn)刀片的機械切力很大,制備一些較大分子如核酸則很少使用,。
2)勻漿器
勻漿器的研缽磨球和玻璃管內(nèi)壁之間間隙保持在十分之幾毫米距離,,破碎細(xì)胞的程度比組織搗碎機高。制作勻漿器的材料,,除玻璃外,還可以用硬質(zhì)塑料,、不銹鋼、人造熒光樹脂等,。
3)研缽
多用于細(xì)菌或其他堅硬植物材料,研磨時常加入少量石英砂,,玻璃粉或其他研磨劑,以提高研磨效果,。
4)細(xì)菌磨
是一種改良了的研磨器,,比研缽具有更大的研磨面積,,而且低部有出口,。操作時先把細(xì)菌和研磨粉調(diào)成糊狀,,每次加入一小勺,研磨20-30秒即可將細(xì)菌細(xì)胞*磨碎。
2,、物理法
主要通過各種物理因素使組織細(xì)胞破碎的方法。在生化制備中常用的方法有:
1)反復(fù)凍溶法
先將樣品深冷至-15---20度使之凍固,,再緩慢的融化,反復(fù)多次,,多用于動物性材料。
2)急熱驟冷法
將材料投入沸水中,,維持85-90分鐘,,至水浴中急速冷卻,此法可用于細(xì)菌及病毒材料,。
3)超聲波處理
頻率一般選在10KC至200KC,,功率200-500瓦范圍,處理時間有數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘不等,,處理過程中注意冷卻。此法多用于微生物材料,。
3、化學(xué)及生物化學(xué)法
有自溶法,,酶解法和表面活性劑法等,。
1)自溶法
在一定PH和適當(dāng)?shù)臏囟认?,利用組織細(xì)胞內(nèi)自身的酶系統(tǒng)將細(xì)胞破碎的方法,。此過程需較長時間,,常用少量防腐劑如甲苯、氯仿等防止細(xì)胞的污染,。
2)酶溶法
利用各種水解酶,,如溶菌酶、纖維素酶,、蝸牛酶,、半纖維素酶,、脂酶等,,將細(xì)胞壁分解,使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來,。有些細(xì)菌對溶菌酶不敏感,加入少量巰基試劑或8摩爾尿素處理后,,使之轉(zhuǎn)為對溶菌酶敏感而溶解。
3)表面活性劑處理
如十二烷基硫酸鈉,、氯化十二烷基吡啶等
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