導語

細胞培養(yǎng)的路上,，有多虐心就有多少需要值得注意的地方。小小的平皿之中，細胞點點，引無數(shù)英雄競掛東南枝,。正所謂“萬事開頭難”，即便是細胞復蘇與保存這兩件看似簡單的事情,，也能造成實驗汪內(nèi)心無比巨大的陰影面積,。好在小魚這里有本細胞培養(yǎng)秘籍，可讓細胞這個熊孩子*變?yōu)槟愕馁N心小棉襖,。

其實,，剛剛復蘇的細胞就像是剛剛出生的baby，非常脆弱,，需要各位小伙伴的細心呵護，不然,，細胞就會被我們花樣玩死,。為了避免細胞不明不白的掛掉，我們就要對細胞的各種習性了如指掌,。

1. 俗語道,，到什么山上唱什么歌，不同細胞用不同的培養(yǎng)液,。此時,，就不得不提起培養(yǎng)基里的“四大金剛”—MEM、DMEM,、1640,、F-12，它們基本參與了90%以上種類細胞的培養(yǎng)過程,。

MEM作為帶頭大哥,，能力非常全面，號稱是應用zui廣泛的細胞培養(yǎng)液,。

DMEM作為隨時緊跟老大MEM的二弟,，青出于藍而勝于藍,，濃度要高出2~4倍，可分為高糖型（含葡萄糖4500mg/L）和低糖型（含葡萄糖1000mg/L）,。

老三1640中規(guī)中矩,，營養(yǎng)成分比較簡單，比DMEM少一點糖和谷光甘肽,，常用于淋巴細胞的培養(yǎng),。

小兄弟F12常用來支持CHO、Hela和L－細胞生長以及原代大鼠肝細胞和前列腺上皮細胞的培養(yǎng),。MEM和F12 這兩種培養(yǎng)基各取1/2,，即可形成神經(jīng)生物學zui通用的培養(yǎng)基。

在此,，奉送一個不同細胞系對應的不同培養(yǎng)液的圖,，供大家參考。

2. 細胞生長的空間密度是細胞培養(yǎng)的關鍵,。具體養(yǎng)細胞時應該摸索細胞喜歡的生長空間密度,，既不能讓細胞瓶里的細胞因擁擠不堪而萎靡不振；也不能讓細胞濃度低于1~5×10^5個/mL而導致“孤獨死”（因為細胞的健康生長需要細胞間的連接）,。因而細胞接種前,，要先通過細胞計數(shù)來調整細胞濃度。

3. 當培養(yǎng)的貼壁細胞形態(tài)不好時,，可在傳代時,，先倒掉舊的培養(yǎng)基，加入3ml新的培養(yǎng)基（有無血清都可以）洗滌一次,，用滴管吸走,，再加入3ml培養(yǎng)基，沿著瓶底輕輕吹打一遍,，然后吸走,。這時在正式進行消化、吹打,。

其次,，把吹打下的細胞懸液加入到含有新培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于培養(yǎng)箱里培養(yǎng),，按時間點觀察細胞貼壁情況（10min,，20min，30min）,。而后迅速倒出其中的培養(yǎng)基,，加入3ml新培養(yǎng)基再輕輕洗一次，然后加入*培養(yǎng)基培養(yǎng)并觀察細胞生長情況以及形態(tài)。直至找到細胞的形態(tài)為止,。

4. 至于在培養(yǎng)瓶中加入多少培養(yǎng)基量,，則是需要實驗汪們自己去摸索的。對于生長快的細胞,，易生長的細胞加少一點培養(yǎng)基,，細胞形態(tài)會更好，但是要注意對換液時間的把握,。

5. 如何選擇培養(yǎng)瓶,。一般，生長速度慢的細胞如果想要更漂亮的細胞狀態(tài),，那么采用塑料瓶會比玻璃瓶的效果好,；生長速度快的細胞，用玻璃瓶培養(yǎng)的效果會更好,。因此,，對于同一種細胞，在其生長速度慢的時候（比如細胞剛復蘇時或者原代培養(yǎng)）,，塑料瓶會好一點,；而在其生長旺盛的時候，玻璃瓶則相對會好一點,。

6. 細胞凍存時,，蓋子要擰緊，不然復蘇水浴時會滲水,，造成細胞污染,。因而凍存管要選擇原配的管子和蓋子（不同牌子、型號的管子會有差別）,，蓋子擰緊后用封口膜封住,。且每支凍存管都要標上細胞的名稱、凍存時間,，并記錄在冊，以免后續(xù)復蘇細胞時,，取錯細胞,。

7. 細胞凍存時要嚴格進行梯度降溫（-4℃→-20℃~-40℃→-80℃→液氮）。要知道冰火兩重天的生活環(huán)境只會讓嬌弱的細胞自爆身亡,，謹記：緩降溫,！但如果真心趕時間時，可以使用細胞凍存盒進行細胞凍存,，而后盡快將其轉入液氮中,。此外，要定期測量液氮罐里的液氮儲備，以保證細胞全部浸在液面下,。

8. 細胞解凍時,，由于凍存管管壁較厚、隔熱,，而導致水浴時間太長（2min還沒融化）時,，可以將水浴鍋的溫度調至40℃左右，可以縮短解凍時間,。

9. 提前預定超凈臺,，減少復蘇后插在冰盒里等待的時間，可避免細胞房人滿為患,，超凈臺使用緊張,，復蘇1h后，還沒有加入新的培養(yǎng)液,。（高濃度DMSO防止胞內(nèi)形成冰晶,，凍存時保護細胞，但復蘇融解后,，浸泡時間太久會對細胞有毒性）

10. 復蘇細胞時一定要有耐心,，因為有些細胞在復蘇一星期后才會真正有起色。因而,，盡管細胞在復蘇三四天后沒有任何動靜,，也不要輕易倒掉所有細胞，要耐心等待,，兩周后再做決定,。

11. 有關DMSO的一些注意事項：

?(1) DMSO能夠快速穿透細胞膜進入細胞中，降低冰點,、延緩凍存過程,，同時提高細胞內(nèi)的離子濃度、減少細胞內(nèi)冰晶的形成,，從而減少細胞損傷程度,。

?(2) DMSO在溶解過程中會放熱，應先與培養(yǎng)基混勻后再加血清,，同時凍存液提前配置,，DMSO現(xiàn)配對細胞的毒性可能更大；

?(3) 復蘇時,，要離心去除DMSO,，并用新鮮的培養(yǎng)基洗滌1-2次，注意離心的時候速度不要太快,。