ELISA 是一種敏感性高、特異性強(qiáng),、重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法，由于其試劑穩(wěn)定、易保存,、操作簡便、結(jié)果判斷較客觀等因素,，以及既適宜于大規(guī)模篩查試驗(yàn)又可以用于少量標(biāo)本的檢測(cè),，既可以做定性試驗(yàn)也可以做定量分析等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于微生物學(xué),、寄生蟲學(xué),、腫瘤學(xué)和細(xì)胞因子等領(lǐng)域。ELISA 的影響因素較多,，加強(qiáng)質(zhì)量管理才能充分發(fā)揮其方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn),。

一、質(zhì)量控制血清

質(zhì)控血清是已有靶值的血清,，在每次的常規(guī)檢驗(yàn)中加入一份或數(shù)份,，通過所得結(jié)果來了解本次檢驗(yàn)的情況。質(zhì)控血清檢驗(yàn)的結(jié)果如能控制其誤差在一定范圍內(nèi),，就說明該檢驗(yàn)沒有發(fā)生不允許的誤差,。如果出現(xiàn)超過允許誤差范圍的異常結(jié)果，提示該檢驗(yàn)不合格,，應(yīng)尋找原因,，糾正后，重檢待測(cè)標(biāo)本,。因此質(zhì)控血清在質(zhì)控工作中起重要作用,。

1.質(zhì)控血清的使用

衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心制備的乙肝標(biāo)志物質(zhì)控血清，可以在-20℃保持半年定值不變,。冰凍狀態(tài)融化使用時(shí),，應(yīng)先混勻,，未用完部分可在4℃保存5天。不宜反復(fù)冰融或自行分裝,。開展某項(xiàng)檢驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)控工作需要的質(zhì)控血清,，一般按3-6個(gè)月用量準(zhǔn)備。自制的不定值質(zhì)控血清,，在一批質(zhì)控血清將用完之前,，需準(zhǔn)備下一批質(zhì)控血清。質(zhì)控血清要求性能穩(wěn)定,，較長期內(nèi)效價(jià)不變,，其理化性質(zhì)應(yīng)與病人樣本相近，這樣才能有效地起到監(jiān)測(cè)作用,。

2.臨界值質(zhì)控血清

質(zhì)控制血清分定值和未定值兩種,。如只用一份質(zhì)控血清定值，一般定在正常值與異常值交界點(diǎn)上,，定性測(cè)定時(shí)處于弱陽性水平,，稱為臨界值。乙肝標(biāo)志物臨界值的制定,，應(yīng)按臨床要求,，為臨床提供統(tǒng)一的判斷弱陽性的標(biāo)準(zhǔn)。 臨界值質(zhì)控血清可以作為試劑盒中的陽性對(duì)照品和陰性對(duì)照品以外的第三個(gè)對(duì)照品,，它可以靈敏地反映出試劑盒的檢出水平,，確保弱陽性反應(yīng)的標(biāo)本不漏檢。

3.質(zhì)控血清的制備

每個(gè)實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)自己的條件,，選用臨床中心提供的質(zhì)控血清,，或按以下方法自己制備本室使用的質(zhì)控血清（以乙肝質(zhì)控血清為例）。

（1）收集新鮮的無溶血,、無黃疸,、無細(xì)菌污染的陽性血清。

（2）56℃加熱10小時(shí)來活,。

（3）離心或過濾除去沉淀,。

（4）用10%的小牛血清或正常人血清（PBS緩沖液）將收集的血清稀釋至所需的濃度。如能用正常的人血清稀釋更好,，因其成份更接近于檢測(cè)標(biāo)本,。

（5）抽濾除菌。按一次使用的量分裝小安瓿,，封口,，20℃保存?zhèn)溆谩２豢煞磸?fù)凍融,。被檢物要求檢出的水平常被認(rèn)為是質(zhì)控血清應(yīng)選擇的水平,。如果該試驗(yàn)還有其它要求,，則應(yīng)加所要求濃度的質(zhì)控物。

（6）標(biāo)定含量,。20-30次測(cè)定結(jié)果刪除>±2SD數(shù)據(jù)的均值作為靶值,，并與已知定值血清對(duì)比測(cè)定。

二,、室內(nèi)質(zhì)量控制程序

臨床檢驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果,，每次或每天之間不可能*。決定允許的誤差范圍,，以臨床上不造成誤診與漏診為準(zhǔn),，通過以下步驟來確定質(zhì)控范圍。

1.*條件下的測(cè)定誤差

*條件下已知值質(zhì)控血清變異（optimal conditions variance,簡稱OCV）的測(cè)定：在本實(shí)驗(yàn)室*條件下（包括操作者,、試劑,、儀器等）檢測(cè)質(zhì)控血清20-30次，測(cè)得結(jié)果計(jì)算,，求出該組數(shù)據(jù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示該實(shí)驗(yàn)室的*工作質(zhì)量,。
 

現(xiàn)舉例說明HBsAg ELISA法檢測(cè)時(shí)OCV的測(cè)定,。使用的質(zhì)控制血清為臨界血清,，HBsAg濃度為5ng/ml。在該實(shí)驗(yàn)室中選擇素質(zhì),、操作zui熟練的技術(shù)員進(jìn)行認(rèn)真地專門測(cè)定,，選用*的試劑盒，檢測(cè)之前,，將恒箱,、加樣器等認(rèn)真校正、調(diào)校正,、調(diào)試,，使用新的加樣吸頭等，即在*,、的條件下進(jìn)行檢測(cè),。除質(zhì)控血清外同時(shí)測(cè)定陰性對(duì)照品和陽性對(duì)照品。并作雙份測(cè)定,，得出2個(gè)吸光值（A值）,，求出X。連續(xù)作20次,，求出20個(gè)X,，即X1……X20。從這20個(gè)數(shù)據(jù)中,，求出OCV的X和SD,。

2.已知值的血清在常規(guī)檢驗(yàn)條件下的誤差

常規(guī)條件下已知值質(zhì)控血清變異（routine conditions variance-known value,簡稱RCVK）的測(cè)定：做常規(guī)檢驗(yàn)的技術(shù)人員,，在常規(guī)檢驗(yàn)的條件下，將質(zhì)控血清放在常規(guī)檢測(cè)樣本中,，進(jìn)行20次檢驗(yàn),，結(jié)果計(jì)算同OCV法。一般認(rèn)為RCV的SD在OCV的SD兩倍范圍內(nèi)可以接受,。若太大應(yīng)該查找原因,，使其向OCV的SD值靠近。在改進(jìn)實(shí)驗(yàn)室條件后（例如較正加樣器,，糾正洗板操作,，調(diào)正溫育溫度等），重新進(jìn)行RCVK的測(cè)定,。如果RCVK的SD值更小,，說明OCV不是*條件下測(cè)定的，應(yīng)重新再測(cè)OCV,。常規(guī)條件下,，RCVK肯定要比OCV大。通過質(zhì)控控制各項(xiàng)條件,，使RCVK的數(shù)據(jù)盡可能接近OCV值,。RCVK的數(shù)據(jù)反映該實(shí)驗(yàn)室日常工作的質(zhì)量，用于作質(zhì)控圖,，對(duì)室內(nèi)檢驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行控制,，每日檢驗(yàn)的結(jié)果，報(bào)告能否發(fā)出,。

3.未知值的血清在常規(guī)檢驗(yàn)條件下的誤差

常規(guī)條件下,未知值質(zhì)控血清變異（routine conditions variancl-unknown value 簡稱RCVU）的測(cè)定：有時(shí)為了避免主觀性,再作RCVU測(cè)定,。測(cè)定步驟同RCVK，但檢測(cè)的操作者不知質(zhì)控血清的定值,，或在操作者不知哪份是質(zhì)控血汪清的條件下進(jìn)行常規(guī)檢驗(yàn),，以排除操作者的主觀性。在此不再舉例說明,。

4.臨床應(yīng)用的要求

對(duì)任何一個(gè)試驗(yàn)都應(yīng)確定一個(gè)允許的誤差范圍,，前題是滿足臨床要求。如允許誤差定得過小,，在臨床上不存在任何意義,，但為了符合該規(guī)定卻要花費(fèi)很大人力、物力和時(shí)間,。相反,，如果將允許誤差定得過大，將使監(jiān)測(cè)系統(tǒng)察覺不到臨床上要求檢出的誤差，失去質(zhì)控的意義,。

三,、室間質(zhì)量評(píng)價(jià)（external quality assessment,簡稱EQA）

室間質(zhì)量評(píng)價(jià)簡稱室間質(zhì)評(píng)，是由質(zhì)控中心采用一系列的辦法連續(xù)地,、客觀地評(píng)價(jià)各實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)結(jié)果,，并發(fā)現(xiàn)室內(nèi)質(zhì)控不易發(fā)現(xiàn)的不準(zhǔn)確性，了解各實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果的差異,，并幫助校正,，使具有可比性。各實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)結(jié)果報(bào)到質(zhì)控中心,，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析,，得出相互比較的結(jié)果。這種評(píng)價(jià)不能控制各實(shí)驗(yàn)室每天發(fā)出的檢驗(yàn)報(bào)告,，而是一種回顧性評(píng)價(jià),。室內(nèi)質(zhì)控主要監(jiān)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果的精密度，而室間質(zhì)評(píng)主要控制試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度,，不能互相替代,。參與質(zhì)評(píng)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)先做好室內(nèi)質(zhì)控。

1.室間質(zhì)評(píng)的方法

（1）發(fā)質(zhì)控物進(jìn)行調(diào)查

這是國內(nèi)外室間質(zhì)評(píng)的常用形式,。部臨檢中心對(duì)乙肝標(biāo)志物ELISA檢驗(yàn)的室間質(zhì)評(píng)采用定期發(fā)放質(zhì)控物至各實(shí)驗(yàn)室,，各實(shí)驗(yàn)室在規(guī)定的日期進(jìn)行檢驗(yàn)，并將檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)至部臨檢中心,。部臨檢中心經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,，將評(píng)價(jià)結(jié)果寄回各實(shí)驗(yàn)室,。通過評(píng)價(jià),，各實(shí)驗(yàn)室了解本室工作質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)差距,，并設(shè)法改進(jìn),，以不斷提高檢驗(yàn)質(zhì)量。 這種評(píng)價(jià)方式有一定缺點(diǎn),，即各實(shí)驗(yàn)室常對(duì)質(zhì)控物特殊對(duì)待,，在檢驗(yàn)時(shí)選用特殊試劑盒，選派特別的技術(shù)員進(jìn)行檢驗(yàn),，有的實(shí)驗(yàn)室互相和對(duì)結(jié)果并作修改,。這就使EQA的結(jié)果不能反映該實(shí)驗(yàn)室日常工作水平。

（2）派觀察員到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試劑調(diào)查

這種調(diào)查事先不通知,，臨時(shí)派觀察員到實(shí)驗(yàn)室,，采用常規(guī)方法，檢驗(yàn)規(guī)定的一組標(biāo)本，進(jìn)行評(píng)價(jià),。這種調(diào)查方式,，容易發(fā)現(xiàn)該實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)際問題，可以直接給予指導(dǎo)和幫助,，解決問題,，提高檢驗(yàn)質(zhì)量。這種調(diào)查通?？梢允褂谜鎸?shí)樣本,，避免采用質(zhì)控物的一些缺點(diǎn)。

2.評(píng)價(jià)方法

（1）發(fā)質(zhì)控物進(jìn)行調(diào)查,，這是目前國內(nèi)外常見的形式,，采用定期發(fā)放質(zhì)控物至各實(shí)驗(yàn)室，各實(shí)驗(yàn)室在規(guī)定的日期進(jìn)行檢驗(yàn),，并將結(jié)果報(bào)至組織者（部,、省臨檢中心）。組織者通過統(tǒng)計(jì)分析,，再將評(píng)價(jià)結(jié)果寄回實(shí)驗(yàn)室,，使其了解工作質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)問題,，提高質(zhì)量,。其缺點(diǎn)為由于各實(shí)驗(yàn)室吃小灶或互相打修改結(jié)果而達(dá)不到真正評(píng)價(jià)作用。

（2）現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查,，事先不通知,，臨時(shí)派出人員到各實(shí)驗(yàn)室，規(guī)定采用常規(guī)方法,，檢測(cè)一組標(biāo)本,，進(jìn)行評(píng)價(jià)。這種方法可以解決實(shí)際問題,，進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)指導(dǎo),，組織者常因人力、物力的原因而不能經(jīng)常性進(jìn)行,。

3.成績計(jì)算方法

（1）定性試驗(yàn)：檢驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致,，得 100 分，錯(cuò)誤不得分,，總計(jì)實(shí)驗(yàn)室的得分,。從全部參評(píng)單位的得分中求出該批質(zhì)控物平均分（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（s），再通過公式計(jì)算出每一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的得分比值（SI）

SI=（實(shí)驗(yàn)室得分-平均分）/平均標(biāo)準(zhǔn)差（s）

SI 在0.0-0.9 間為良好,1.0-1.9 間為,SI 為負(fù)值時(shí)數(shù)值越大成績?cè)讲睢?/p>

（2）定量試驗(yàn)：SI= （實(shí)驗(yàn)室測(cè)定值-預(yù)期值X）/預(yù)期值的標(biāo)準(zhǔn)差s ; SI 越小,，表明越靠近靶值,，成績?cè)胶谩?/p>

0-1.0 為,1.1-2.0 為良好,>2.0 為差,。SI 無正負(fù)之分

四、質(zhì)量改進(jìn)（Quality Improvement,，QI）

質(zhì)量改進(jìn)的建議來源于三方面：

（1）室內(nèi)質(zhì)控：提示實(shí)驗(yàn)的精密度差,，應(yīng)規(guī)范各項(xiàng)操作；

（2）室間質(zhì)評(píng)：提示實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性差,，應(yīng)改進(jìn)設(shè)備的準(zhǔn)備或更換試劑,；

（3）病人或醫(yī)生的報(bào)怨：提示實(shí)驗(yàn)的偶然誤差，應(yīng)分析實(shí)驗(yàn)的質(zhì)控過程是否達(dá)標(biāo),。

五,、記錄

1.所有實(shí)驗(yàn)的原始資料均應(yīng)存檔；所有的記錄均應(yīng)規(guī)范登記在冊(cè),；原始登記表應(yīng)記錄試劑來源,、批號(hào)；質(zhì)控血清的來源及測(cè)定值并注明是否在控,；簽上實(shí)驗(yàn)者姓名及審核者姓名,。

2.如試驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床診斷有決定意義，其樣本應(yīng)保留,，至少與病歷保存期一致,。