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免疫放射分析技術(shù):核素標(biāo)記的抗體檢測(cè)抗原

來(lái)源:武漢貝茵萊生物科技有限公司   2010年12月03日 11:36  

1968年Miles和Hales建立了利用核素標(biāo)記的抗體檢測(cè)抗原的放射分析法,為了與放射免疫分析區(qū)別,,故稱免疫放射分析技術(shù)(immunoradiometric assay,,IRMA)。由于它應(yīng)用核素標(biāo)記抗體作為示蹤劑,,在反應(yīng)體系中加入過(guò)量的抗體,,待測(cè)抗原(或標(biāo)準(zhǔn)品)與和核素標(biāo)記抗體進(jìn)行全量反應(yīng),故亦稱非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析法,。IRMA與RIA相比較有以下特點(diǎn):

1,、IRMA反應(yīng)系統(tǒng)中應(yīng)用的標(biāo)記物為免疫球蛋白。易于提純和進(jìn)行碘化標(biāo)記,,標(biāo)記抗體的比活度較高,,有利于提高分析的靈敏度,且不同抗體的標(biāo)記方法基本相同,;而在RIA中應(yīng)用的標(biāo)記物是抗原,。抗原種類繁多,,化學(xué)結(jié)構(gòu)各異,較難獲得純品,,標(biāo)記方法亦多種多樣,。

2、在IRMA反應(yīng)系統(tǒng)中使用過(guò)量的標(biāo)記抗體,,直接與抗原結(jié)合,,不存在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的復(fù)雜反應(yīng),因此反應(yīng)速度較快,,即使使用親和力較低的單可隆抗體,,也能滿足實(shí)驗(yàn)要求;而在RIA中抗體是微量的,,所以一定要用高親和力的多可隆抗體

3,、IRMA使用的標(biāo)記抗體和固相抗原在反應(yīng)中都是過(guò)量的,只有待測(cè)樣品加樣誤差才會(huì)影響分析結(jié)果,,因此IRMA的批內(nèi)和批間變異(CV%)比較?。欢鳵IA使用的抗體和標(biāo)記抗原在反應(yīng)中是固定量的,,加樣誤差可嚴(yán)重影響測(cè)定結(jié)果,。

一、基本原理

將核素標(biāo)記在抗體上,,然后以過(guò)量的標(biāo)記抗體與待測(cè)抗原結(jié)合,,未結(jié)合的標(biāo)記抗體通過(guò)和固相的抗原免疫吸附劑結(jié)合而去除,,溶液中的放射性與待測(cè)抗原的含量呈正相關(guān)。根據(jù)檢測(cè)過(guò)程的操作步驟不同,,有以下幾種類型

1,、直接IRMA法

將待測(cè)抗原與過(guò)量的標(biāo)記抗體進(jìn)行溫育,使二者結(jié)合,,然后加入固相抗原免疫吸附劑再次溫育,,吸附游離的標(biāo)記抗體。離心去除沉淀物,,測(cè)定上清液中放射性強(qiáng)度,,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得知待測(cè)樣品中抗原的含量。

2,、雙抗體夾心IRMA法

在待測(cè)抗原內(nèi)依次加入固相抗體和標(biāo)記抗體,,反應(yīng)后形成固相抗體(Ab1)-抗原-標(biāo)記抗體(Ab2)復(fù)合物,洗滌去除游離的標(biāo)記抗體,,測(cè)定固相抗體或載體上免疫復(fù)合物的放射性強(qiáng)度,,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得知待測(cè)樣品中抗原的含量。此法僅用于檢測(cè)有多個(gè)決定簇的多肽和蛋白質(zhì)抗原,。

3,、間接IRMA法

此法是在上述雙抗體夾心法的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步改良為用核素標(biāo)記抗Ab2的抗體(羊抗兔或抗鼠的IgG),,反應(yīng)后形成固相抗體(Ab1)-抗原-Ab2-*Ab3(標(biāo)記抗抗體)的四重免疫復(fù)合物,。其中,Ab3可作為通用試劑,,可省去標(biāo)記針對(duì)不同抗原的特異性抗體,。

4、BSA-IRMA法

是將生物素-親合素系統(tǒng)(BSA)引入免疫放射分析,,建立的新一代IRMA,。此法zui大的優(yōu)點(diǎn)是使用生物素化抗體和以核素標(biāo)記親合素為示蹤劑,,可以通用于甾體類,、前列腺素等小分子物質(zhì)的檢測(cè)。由于1個(gè)抗體分子上可標(biāo)記數(shù)十個(gè)生物素分子,,而每個(gè)親合素又可與4個(gè)生物素分子結(jié)合,,從而產(chǎn)生多級(jí)放大效應(yīng)。同時(shí)生物素與親合素之間的親和力要比抗原抗體間的親和力大10萬(wàn)-100萬(wàn)倍,,二者結(jié)合極為穩(wěn)定,,因此,使其靈敏度,、特異性和精密度都大大提高,。目前一些超靈敏度的IRMA分析試劑盒就是應(yīng)用上述原理制成的,。

二、基本試劑及材料

1,、標(biāo)記抗體

2,、固定抗原吸附劑

3、標(biāo)準(zhǔn)抗原

4,、待測(cè)樣本

5,、γ計(jì)數(shù)儀和低溫離心機(jī)

三、操作方法

以固相雙抗體法測(cè)定血清中促甲狀腺素(TSH)為實(shí)例

1,、按下表逐一加樣(加樣量為ml,,均設(shè)雙復(fù)管)

 

混勻,37℃溫育120min

棄上清(T*除外,,以下同),,加2ml洗滌液,放置2min

棄上清,,再加2ml洗滌液,,放置2min

棄上清,將各管倒置在吸水紙上

2,、用γ計(jì)數(shù)儀分別測(cè)量各管放射性強(qiáng)度,,以兩管cpm的均值表示,分別計(jì)算結(jié)合率(B%,,即B/T* ´100%)

3,、用B%為縱坐標(biāo),不同濃度的TSH標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,,然后根據(jù)檢測(cè)管的B%,從標(biāo)準(zhǔn)曲線中即可查得相應(yīng)的TSH含量

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