50%溶血試驗即求得能使50%致敏羊紅細(xì)胞發(fā)生溶血的zui小量血清,然后計算出每毫升血清中補體含量,。 以補體量作為橫坐標(biāo),,溶血百分?jǐn)?shù)作為縱坐標(biāo),可得到一個清晰的“S”形曲線,。在50%溶血周圍,,線段近似一條直線。因此當(dāng)補體用量稍有變動,,就可對溶血程度發(fā)生很大影響,。所以用50%溶血作為終點要比100%溶血更為敏感。 50%溶血試驗定血清中補體含量用以下公式表示:每毫升血清中補體含量(單位)=(1/血清用量)×稀釋倍數(shù),。 該公式可以從Von Krogh 方程式進一步加以論證:x=k[1/(1-y)]1/n,。假定X=加入的新鮮血清量,y=溶血的百分率,,以小數(shù)表示,,V=斜率,k=常數(shù),,轉(zhuǎn)變成對數(shù),上述公式就變成:logx=logk+1/n log[y/(1-y)],,當(dāng)以50%溶血作為終點時,,y/(1-y)=0.5/(1-0.5)=1,代入上述公式,,log x=log k+1/n log1,,由于-log1=0,log x=log k,,x=k,,也即表示補體的50%溶血單位k就是加入的新鮮血清量。 材料及器材 1,、稀釋液(磷酸鹽緩沖生理鹽水): NaCl | 17g | Na2HPO4 | 11g | KH2PO4 | 0.27g | 蒸餾水 | 100ml | 使用時取此原液50ml,,加90ml蒸餾水,經(jīng)高壓滅菌后即可使用。加入100%硫酸鎂溶液1ml,,可增強補體的效能,; 2、綿羊紅細(xì)胞懸液(1×10g/ml),; 3,、溶血素(2U); 4,、被檢血清(新鮮豚鼠血清),; 5、水平離心機,; 6,、水浴箱; 7,、721型分光光度計,。 方法 1、濃度為1×10g/ml的綿羊紅細(xì)胞配制 取經(jīng)稀釋洗滌后的綿羊紅細(xì)胞配成較5%稍濃的細(xì)胞懸液,。取50%細(xì)胞懸液1ml,,加于14ml蒸餾水中測 O.D值為DI按下式求出于一定體積的5%細(xì)胞懸液中應(yīng)加入稀釋液的毫升數(shù)。 Vf=Vi(Di-Ds)/Ds,,Vi為配制的50%細(xì)胞懸液體積,,Vf為于一定量5%細(xì)胞懸液中應(yīng)加入稀釋的ml數(shù)Ds為已知標(biāo)準(zhǔn)化的1×100個細(xì)胞/ml懸液的OD540值-0.385。 2,、致敏綿羊細(xì)胞 取綿羊紅細(xì)胞懸液(1×102/ml)加等量的溶血素(2U/ml),。充分混合。置37℃水浴中作用30分鐘,,每隔10分鐘搖動一次以免細(xì)胞下降即成5×108/ml致敏羊紅細(xì)胞,。 3、補體CH50單位測定 (1)按下表加樣,; (2)將各管充分混合,,置37℃水浴中60分鐘(搖動1~2次,以免紅細(xì)胞下沉),; (3)從水浴中取出后,,立即將各管以2000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,將各管上清液分別移于另一試管,; (4)測定各管上清液OD值(波長=540nm),。 4、補體CH50單位的計算 從測定管(第1~5管)及溶血對照管(第6管)的OD值中減去紅細(xì)胞對照管(第7管)的OD值,。再減去按待測血清每管實際用量計算出的血清色度OD值(80/800ⅹ該管實際量ⅹ第8管OD值),。即為測定管的校正OD值。然后計算各測定管的溶血率(y值),再計算各管的y/(1-y)值,。在雙對數(shù)坐標(biāo)紙上,,以y/(1-y)值為橫坐標(biāo),血清用量為縱坐標(biāo),,得到一條直線,。由于50%溶血(y=0.5)的y/(1─y)值等于1。即可由橫坐標(biāo)等于1的一點,,在直線上求得在縱坐標(biāo)上相應(yīng)的截距,,此即產(chǎn)生50%溶血的待測血清實際用量。zui后,,按下列公式計算出每毫升待測血清的總補體活性,,以單位/毫升表示之。 |