內(nèi)毒素

內(nèi)毒素致病性

Pfeiffer于十九世紀(jì)首先提出“內(nèi)毒素”一詞，研究表明,，內(nèi)毒素在機(jī)體內(nèi)作用于單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子（腫瘤壞死因子TNF,，白細(xì)胞介素IL，干擾素Interferon,，凝血素等）,。當(dāng)這些因子在機(jī)體內(nèi)過(guò)量時(shí)，則可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)發(fā)熱,、低血壓、休克,、多器官功能衰竭甚至死亡,。

因此，人和動(dòng)物的注射藥物,、生物制品和醫(yī)療器械的終端產(chǎn)品中的內(nèi)毒素的檢測(cè)和去除顯得尤為重要,。

內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的一部分，其主要成分為脂多糖（LPS）,，經(jīng)細(xì)菌細(xì)胞裂解后釋放出來(lái),。LPS可以分為三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：特異性O(shè)鏈、核心寡聚糖和類(lèi)脂A,，如下圖所示：

內(nèi)毒素特性

• 性質(zhì)穩(wěn)定：160℃的溫度下加熱2-4個(gè)小時(shí),，或用強(qiáng)堿,、強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑加熱煮沸30分鐘才能破壞它的生物活性。
• 經(jīng)甲醛溶液處理后,，可降低其毒性,，但不能成為類(lèi)毒素。

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  中國(guó)藥典（CP）規(guī)定,，藥品,、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）一般按以下公式確定：

  L=K/M

   

  式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，以EU/ml,、EU/mg或EU/U（活性單位）表示,；

  K為人每公斤體重每小時(shí)zui大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/(kg• h)表示,，注射劑K=5 EU/(kg• h),，放射性藥品注射劑K=2.5 EU/(kg• h)，鞘內(nèi)用注射劑K=0.2 EU/(kg• h),；

  M為人用每公斤體重每小時(shí)zui大劑量,，以ml (kg• h)、mg(kg• h)或U/(kg• h)表示,，人均體重按60 kg計(jì)算,，人體表面積按1.62 m2計(jì)算，注射時(shí)間若不足1小時(shí),，按1小時(shí)計(jì)算,。

  按人用劑量計(jì)算限值時(shí)，如遇特殊情況,，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實(shí)際情況做必要調(diào)整,，但需說(shuō)明理由。

   

  美國(guó)藥典（USP）規(guī)定,，非經(jīng)腸道藥品的內(nèi)毒素限值,，以劑量定義，等于：K/M,。

  除了鞘內(nèi)給藥以外的任何給藥途徑,，K均為5 USP-EU/kg，鞘內(nèi)給藥時(shí),，K為0.2 USP-EU/kg,，對(duì)于非鞘內(nèi)給藥放射性藥品，內(nèi)毒素限值的計(jì)算為175/V,，V為以ml為單位的zui大推薦劑量,，對(duì)于鞘內(nèi)給藥的放射性藥品，其內(nèi)毒素限值為14/V,，對(duì)于按以每平方體表面積計(jì)算的給藥劑量（通常是抗腫瘤藥品）,，計(jì)算公式為K/M,，其中K=5 EU/kg，M為(zui大劑量/m2/小時(shí)×1.80m2)/70kg,。

  檢測(cè)方法的建立：

  1968年,，由Leivin和Bang發(fā)現(xiàn)并建立了利用鱟試劑檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的方法。他們發(fā)現(xiàn),，當(dāng)遇到內(nèi)毒素時(shí),，鱟的血液能夠凝結(jié)成塊。用鱟血液中的變形細(xì)胞提取物與待檢樣品混合,，如果待檢樣品中含有內(nèi)毒素,，則會(huì)觀察到上述情況。鱟試驗(yàn)法（LT）已經(jīng)替代了熱原檢查家兔法檢驗(yàn)藥品中的內(nèi)毒素,。

  目前FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了以下LAL檢測(cè)法：凝膠法（ToxinSensorTM凝膠法內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒）,、濁度法和顯色法（ToxinSensorTM顯色法LAL內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒）。

   

  LAL檢測(cè)方法原理圖

   

  

   

  半定量測(cè)定——凝膠法

  通過(guò)鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來(lái)半定量?jī)?nèi)毒素的方法,，是各國(guó)藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法,。

  定量測(cè)定——濁度法和顯色法

  濁度法（動(dòng)態(tài)濁度法和終點(diǎn)濁度法）是通過(guò)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過(guò)程中的濁度變化來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。終點(diǎn)濁度法是基于細(xì)菌內(nèi)毒素濃度和反應(yīng)混合物的終點(diǎn)濁度( 吸收度或透光率) 之間的定量關(guān)系的一種檢測(cè)方法,；動(dòng)態(tài)濁度法（又稱(chēng)動(dòng)態(tài)比濁法）是檢測(cè)反應(yīng)混合物的濁度上升某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間,，或是檢測(cè)濁度增加速度的方法。

  顯色法（動(dòng)態(tài)顯色法和終點(diǎn)顯色法）是將鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng),，可使特定底物顯色,，通過(guò)釋放出的呈色團(tuán)的多少來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素含量，又稱(chēng)為比色法,。終點(diǎn)顯色法是依據(jù)反應(yīng)混合物中內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)釋放出的呈色團(tuán)的量之間存在的量化關(guān)系來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法,。動(dòng)態(tài)顯色法是檢測(cè)反應(yīng)混合物的色度達(dá)到某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間, 或檢測(cè)色度增長(zhǎng)速度的方法。

   

  內(nèi)毒素檢測(cè)方法的選擇：

  凝膠法——僅需檢測(cè)樣品的內(nèi)毒素*,。此法操作比較簡(jiǎn)單,、經(jīng)濟(jì)，不需要測(cè)定設(shè)備,，可進(jìn)行定性或半定量測(cè)定,。

  顯色法（或濁度法）——定量測(cè)定樣品中內(nèi)毒素含量。

• 日常檢測(cè)量不大時(shí),，可以選擇終點(diǎn)顯色法，用普通的分光光度計(jì)就可完成實(shí)驗(yàn),。
• 檢測(cè)的樣品是生物制品,、疫苗、血液制品等選用終點(diǎn)顯色法或動(dòng)態(tài)顯色法,。
• 檢測(cè)量比較大,，檢測(cè)的樣品對(duì)鱟試劑的干擾不大,，可選用動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑。

• 注：動(dòng)態(tài)濁度法與動(dòng)態(tài)顯色法需要帶溫育系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)光度測(cè)定儀器及配套軟件,。