液相色譜儀(HPLC)是分析實(shí)驗(yàn)室常用的測(cè)試儀器之一，其應(yīng)用越來(lái)越廣泛,。此種儀器在使用過(guò)程中，難免會(huì)出現(xiàn)各種各樣的問(wèn)題，并將直接影響到所測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和儀器的正常工作,。操作者如果能了解故障的成因，即可清楚預(yù)防和排除這些故障的方法,，就可正確地使用儀器并zui大限度地發(fā)揮儀器的性能,。今天我們要從以下幾個(gè)方面和您分享下在使用液相色譜儀中需注意的幾個(gè)問(wèn)題,。一、使用試管的問(wèn)題1,、試管的潔凈問(wèn)題,。液相色譜分析法是一個(gè)很靈敏的分析方法，如果因使用不潔凈的試管,，便會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,。例如，在用甲醇作溶劑來(lái)溶解樣品時(shí),，所用的小試管是用橡膠塞來(lái)做蓋子的,，因此，在每次進(jìn)樣時(shí),，都有一個(gè)保留時(shí)間固定的干擾峰存在,，后經(jīng)證實(shí)，此干擾峰是由甲醇浸泡橡膠塞而溶下的組分所產(chǎn)生,，換用玻璃試管后,，干擾峰消除。2,、塑料試管的溶解問(wèn)題,。近年來(lái)，一次性塑料試管給試驗(yàn)人員帶來(lái)了極大的方便,，但是,，在使用過(guò)程中一定要注意有機(jī)溶劑對(duì)試管的溶解現(xiàn)象，在利用此種試管提取樣品時(shí),，有些有機(jī)溶劑對(duì)管壁有溶解現(xiàn)象,，這些被溶解下來(lái)的物質(zhì)有時(shí)也能在檢測(cè)器上產(chǎn)生信號(hào)，從而干擾樣品的測(cè)定,。這時(shí),，可用相同的實(shí)驗(yàn)條件先行試驗(yàn)一下，看看不含被抽提物時(shí),，提取液在檢測(cè)器上能否產(chǎn)生干擾信號(hào),，如確有干擾信號(hào)存在，就只能換用耐有機(jī)溶劑的玻璃試管了,。3,、被測(cè)樣品在試管壁上的吸附問(wèn)題。這個(gè)問(wèn)題也應(yīng)引起注意,，否則也會(huì)影響測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性,，在治療藥物監(jiān)測(cè)(Therapeutic Drug Monitoring,TDM)中，有些被測(cè)藥物如阿米替林,，丙咪嗪等易吸附在玻璃試管的管壁上,，因此,，操作中宜采用聚丙烯管，為防止提取中吸附現(xiàn)象的發(fā)生,，可采用0.5%的已二胺已烷液做為提取劑,，可有效地防止吸附。二,、操作進(jìn)樣閥的問(wèn)題目前,，在分析型液相色譜儀中常用的進(jìn)樣閥是7725型進(jìn)樣閥，其內(nèi)部的六通閥結(jié)構(gòu)使進(jìn)樣操作非常方便,，但是,，如果使用不當(dāng)，也會(huì)帶來(lái)問(wèn)題,。例如,，在液相色譜法的試驗(yàn)過(guò)程中，有時(shí)會(huì)有異常色譜峰的出現(xiàn)以及重現(xiàn)性不好的問(wèn)題,，這主要是由于操作方法不當(dāng)所引起,，要想解決此類問(wèn)題，需從以下幾個(gè)方面入手,。1,、進(jìn)樣量的控制。用進(jìn)樣閥來(lái)進(jìn)樣時(shí),，閥內(nèi)的樣品環(huán)是定量的,，(一般分析型進(jìn)樣閥的樣品環(huán)體積為20ul)，由于進(jìn)樣時(shí),，注射到進(jìn)樣閥內(nèi)的樣品溶液在樣品環(huán)的管路中有徑向的速度梯度(即管軸處比管壁處的液流速度快),。因此，要想使樣品環(huán)中充滿樣品溶液,，從而使用進(jìn)樣閥來(lái)準(zhǔn)確地定量，則必須使進(jìn)樣量大于樣品環(huán)體積的2倍,。如果用注射器來(lái)控制進(jìn)樣量,，則zui大只能注射樣品環(huán)體積1/2的量，這樣才能防止部分樣品由溢流管溢出從而導(dǎo)致定量分析的誤差,。2,、進(jìn)樣閥的清潔問(wèn)題。如果樣品環(huán)中有上次進(jìn)樣時(shí)樣品的殘留,，必然會(huì)污染下次注射進(jìn)的樣品,，為防止這種現(xiàn)象的發(fā)生，應(yīng)按下列步驟操作：a.進(jìn)樣閥有2個(gè)位置,，INJECT和LOAD,。首先在LOAD位置時(shí),，以注射器將流動(dòng)相注入進(jìn)樣閥內(nèi)清洗幾次，每次用量大約40ul,；b.然后將進(jìn)樣閥板手扳至INJECT位置時(shí),，再以流動(dòng)相清洗幾次，每次用量還是40ul,；c.zui后,，再將樣品注射到進(jìn)樣閥里。按照上述的步驟操作,，可以避免由進(jìn)樣閥引起的污染,，從而使干擾峰消除并提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。3,、進(jìn)樣閥溢流管的堵塞,。有時(shí)，進(jìn)樣閥的溢流管會(huì)發(fā)生堵塞現(xiàn)象,，向進(jìn)樣閥內(nèi)注射樣品時(shí),，注射針推不動(dòng)。此故障是由于溢流管的堵塞所致,。堵塞的原因多半是由于溶解樣品的流動(dòng)相用的是鹽溶液,，而其中的鹽在溢流管的排空端口處結(jié)晶所致。此時(shí),，可用小燒杯盛少量蒸餾水對(duì)溢流管口稍加浸泡,，端口處鹽的結(jié)晶就能被溶解掉，故障排除,。如能在每次進(jìn)樣完成之后,，用蒸餾水反復(fù)沖洗至溢流管中的鹽分全部沖出，則可避免此故障的發(fā)生,。三,、流動(dòng)相(MOBLLE PHASE)的問(wèn)題甲醇和乙腈在液相色譜分析法中常常被用來(lái)配制流動(dòng)相。液相色譜法中常用的試劑是高等級(jí)的試劑,，如色譜純?cè)噭?。在要求不太?yán)格時(shí)，優(yōu)級(jí)純甚至分析純的試劑也能用,。液相色譜分析法中常用的是紫外檢測(cè)器,，因此，從降低基線噪音和提高分析靈敏度上來(lái)考慮,，應(yīng)該使用紫外吸收小且雜質(zhì)含量少的色譜純?cè)噭?,、流動(dòng)相的過(guò)濾。配制好的流動(dòng)相在使用前一定要先用0.5um孔徑的微孔濾膜來(lái)過(guò)濾,。這是因?yàn)槿芤褐泻泻芏嗳庋垭y以發(fā)現(xiàn)的微小顆粒,，如果不把它們?yōu)V除掉,，就會(huì)堵塞泵口、柱頭上的過(guò)濾器,，這樣就堵塞了流動(dòng)相的正常通道,，使色譜柱的阻力增加，柱壓升高,，柱效下降,。碰到這種情況時(shí)，要換用經(jīng)過(guò)濾的流動(dòng)相,，并將堵塞的濾器拆下來(lái)浸泡在20%的硝酸水溶液中以超聲波清洗機(jī)清洗20分鐘,，以除去濾片上的堵塞物。2,、流動(dòng)相的脫氣,。流動(dòng)相在使用前必須脫氣，以盡可能的除去溶解在流動(dòng)相中的氣體,，否則,，這些氣體會(huì)使柱填料的性能降低，還能夠?qū)z測(cè)器的信號(hào)產(chǎn)生很大的干擾,。脫氣有多種方法,，如超聲脫氣、真空脫氣,、氮?dú)饷摎獾?。真空脫氣法和氮?dú)饬髅摎夥ㄊ悄壳皕ui常用的脫氣法。水和甲醇混合后會(huì)產(chǎn)生大量的氣泡,，如果不脫氣就使用,，氣泡就會(huì)進(jìn)入色譜柱和檢測(cè)器，并將影響分析工作的正常進(jìn)行,。 四,、色譜柱的使用和保養(yǎng) 色譜柱是液相色譜儀zui主要的部件，被測(cè)物質(zhì)能否被很好的分離和測(cè)定,，色譜柱的性能起著決定性的作用,。因此，在日常工作中,，應(yīng)特別注意色譜柱的正確使用和維修保養(yǎng)，以延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命,。1,、使用預(yù)柱和保護(hù)柱。預(yù)柱(pre-column)安裝于泵和進(jìn)樣器之間,，它給色譜柱中的流動(dòng)相提供了*的平衡,，并防止了對(duì)柱填料有破壞作用的組分或污染物進(jìn)入色譜柱,。保護(hù)柱(guard column)可以阻擋能夠牢固地吸附于色譜柱上的組分進(jìn)入色譜柱，保護(hù)柱應(yīng)與色譜柱的填料相同,。預(yù)柱和保護(hù)柱可以經(jīng)常更換,，而不需要經(jīng)常更換色譜柱，這就延長(zhǎng)了色譜柱的使用壽命,。2,、防止氣體進(jìn)入色譜柱。有些色譜柱(如凝膠柱)是不允許氣泡進(jìn)入的,，否則將會(huì)使柱效降低甚至形成微小的難以驅(qū)除的氣室,。因此，為了防止氣泡進(jìn)入色譜柱,，一定要使用經(jīng)過(guò)脫氣的流動(dòng)相,，并且要嚴(yán)格按照下列步驟來(lái)安裝色譜柱。a.拆卸下色譜柱入口處的密封螺絲,，觀察是否有溶劑滲出,；b.如有溶劑滲出，即可將色譜柱接到管路上,，以避免氣泡的進(jìn)入,；c.如無(wú)溶劑滲出時(shí)，表明色譜柱的此端已經(jīng)進(jìn)去空氣了,，此時(shí),，可將色譜柱的出口端接到進(jìn)樣閥上，以流動(dòng)相來(lái)反方向沖洗色譜柱,，以便將柱內(nèi)的空氣排除,。以0.2ml/min的小流量來(lái)沖色譜柱，如果溶劑的流速太快或者是壓力突然的上升都將會(huì)導(dǎo)致柱性能的降低,；d.如果流出的溶劑里不含有氣泡,，說(shuō)明柱內(nèi)的氣體已經(jīng)被排出了，再將色譜柱以正確的方向接好,，這樣氣泡就進(jìn)不到色譜柱里面了,。3、色譜柱的清洗,。為了不使被測(cè)物質(zhì)和雜質(zhì)停留在色譜柱中,，在每次的樣品分析工作完成之后，都應(yīng)及時(shí)地清洗色譜柱,。首先要用對(duì)被測(cè)樣品洗脫能力強(qiáng)的溶劑來(lái)洗脫色譜柱,，以分析工作中常用的反相色譜分析法為例，因其先流出的物質(zhì)是極性大的物質(zhì)，此時(shí)應(yīng)用100%的甲醇或使用異丙純,、四氫呋喃等極性稍弱的溶劑將吸附在柱內(nèi)的極性小的物質(zhì)洗脫下來(lái),，洗脫液的用量一般為柱體積的20倍即可。如果流動(dòng)相是緩沖溶液,，則應(yīng)先用蒸餾水來(lái)沖洗色譜柱,，以沖掉柱內(nèi)的鹽，然后再用合適的溶劑來(lái)沖洗,。凝膠濾過(guò)色譜法(Gel Filtration Chromatography)中所使用的凝膠柱常用緩沖溶液做流動(dòng)相,，用完之后當(dāng)然要用蒸餾水來(lái)沖洗。如果是連續(xù)操作,，可以將緩沖溶液置于柱內(nèi),，但是維持小流速(＜0.5ml/min)以防止緩沖鹽的析出，如果流動(dòng)相中含有鹵化物,，即使是停一夜,，也必須要用蒸餾水將色譜柱沖洗干凈，以防止它們對(duì)柱體的腐蝕,。4,、色譜柱的存放。如果色譜柱暫時(shí)不用,，存放時(shí)要注意以下幾點(diǎn)：a.幾天之內(nèi)的短期放置,，應(yīng)先用溶劑沖洗好色譜柱(如凝膠柱則用蒸餾水來(lái)沖洗)，再把色譜柱的兩頭用密封螺絲密封好即可,。b.如果色譜柱長(zhǎng)期不用,，僅用上述方法來(lái)處理就不行了，這時(shí)應(yīng)使用色譜柱使用說(shuō)明書(shū)中所指明的溶劑來(lái)充滿色譜柱,，反相柱一般使用甲醇,，正相柱則可用正已烷或庚烷，而凝膠柱則不能用水了,，因柱內(nèi)如果有微生物的生長(zhǎng)則會(huì)使柱效降低,，此時(shí)應(yīng)用0.05%的NaNs水溶液(防腐劑)來(lái)沖洗色譜柱，再將色譜柱封嚴(yán),。色譜柱長(zhǎng)期放置時(shí),，一定要將色譜柱的兩端封嚴(yán)，以防止由于溶劑揮發(fā)而造成的柱填料干縮現(xiàn)象,，因這可導(dǎo)致柱效的嚴(yán)重降低,。c.色譜柱應(yīng)貯存在室溫下，如果放置于0℃以下的環(huán)境里,，柱內(nèi)就會(huì)結(jié)冰,，這也將導(dǎo)致柱效的降低,。五、色譜峰的雙峰問(wèn)題長(zhǎng)期使用后的色譜柱,，如果有雜質(zhì)進(jìn)入，就會(huì)使色譜柱入口處的固定相“板結(jié)”并在流動(dòng)相所產(chǎn)生的高壓作用下,，形成柱頭的塌陷,，被分析的樣品組分的正常色譜峰就變成了雙峰，這時(shí)可按下述方法來(lái)修復(fù)色譜柱,。首先將柱頭的緊固螺母旋下,，這時(shí)就會(huì)發(fā)現(xiàn)柱頭內(nèi)的固定相已被壓縮進(jìn)去了，嚴(yán)重時(shí)可縮進(jìn)10mm以上,。在這種情況下,，我們可用針尖將流動(dòng)相表層板結(jié)變黃的部分摳掉，并以相同的固定相將此塌陷區(qū)填平,、壓實(shí),，再將色譜柱的緊固螺絲上緊，修復(fù)工作即告結(jié)束,。用經(jīng)過(guò)修復(fù)后的色譜柱再做樣品時(shí),，色譜峰就恢復(fù)正常了。