實驗步驟
1,、首先將上海凈信的組織研磨機上的制冷模塊預(yù)先置于-20℃,使用時取出安裝好,。將研磨珠去RNA酶處理,。
2、隨機抽取小鼠的尾巴100µg,,把樣本剪成盡可能小段,,置于無RNA酶的2研磨單位離心管中(選擇耐液氮冷凍管子),同時加入1顆5號研磨珠和2顆3號研磨珠(如果選擇1.5研磨單位離心管,,只需要加入4-5顆3號研磨珠),。
3、放置于液氮中一起浸泡3分鐘,,取出放置于預(yù)冷模塊中,,在全自動樣品研磨儀上選擇13單位頻振研磨60s。(該步驟可以根據(jù)研磨的細微程度要求可以再重復(fù)一遍)
4,、把研磨好的樣本加入0.06ml的PBS0.14ml的RNAiso Plus(此處選擇PBS,,可以根據(jù)實驗需要加入其他提取液,如1ml TRIzol等),,繼續(xù)置于研磨機上選擇13單位頻振研磨60s,。樣本將處于糊狀。(其他提取試劑有可能會出現(xiàn)泡沫,,不影響實驗)
5,、取出研磨管,放入冷凍離心機中,,于4度,,12000g離心10分鐘
6,、小心吸取上清液0.1ml至新的1.5研磨單位離心管中,蓋上管蓋,,在室溫上孵育15分種,,使樣品充分裂解至勻漿液較透明,如果仍有少量顆粒屬于正常情況,,不影響RNA提取質(zhì)量和得率,。
7、在1.5研磨單位離心管中加入0.02ml,,蓋緊管蓋,,振蕩混勻并將其在冰上孵育15分種,于4度,,12000g離心15分鐘,。離心后混合物分層:上清層,中間層,,下層,;RNA存在于上清層中。
8,、將上清層小心轉(zhuǎn)移到一干凈的離心管中,,加入等體積冰浴的異丙醇,顛倒振蕩混勻,,將混合的樣品在-20度條件,,孵育20分種,于4度,,12000g離心10分鐘。RNA沉淀通常形成片狀沉淀附著于管壁或管底,。
小心棄去上清,,用1ML的冰浴75%的乙醇洗滌RNA沉淀一次,顛倒洗滌離心管管壁,,并旋渦振蕩樣品,,盡可能讓沉懸浮,于4度,,12000g離心5分鐘,,再次去除上清,晾干沉淀,。
10,、操作的后,在陰涼處適度干燥RNA沉淀(避免過分干燥,,那樣會降底它的可溶性),。
11,、用適量(一般可用0.01—0.02ml)的無RNA酶水或TE溶液來溶解RNA。抽提好的RNA,,保存于-70度,。
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