Gibco 10270-106 細(xì)胞培養(yǎng)小常識

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Gibco 10270-106 細(xì)胞培養(yǎng)小常識

1）切記，細(xì)胞培養(yǎng)基的儲存條件是2-8℃,。如果細(xì)胞培養(yǎng)基不小心被凍,，您應(yīng)該融化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒有沉淀產(chǎn)生,，培養(yǎng)基可以正常使用,，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基,。

2）貯存在冰箱中的瓶口已開的培養(yǎng)基,，可能在放置幾天后顏色變紫。這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時,，碳酸氫鈉導(dǎo)致了pH值的上升,。您可以在使用前松開瓶口，在CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基10-15min,，來校正溶液的pH值(確定松開瓶口以保證氣體交換),。

3） 當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%,。血清蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素,。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活,，可能對于細(xì)胞達(dá)到毒性水平,。

4）一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它,。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解,。

5）總之，大部分添加物和試劑zui多可以凍融3次,，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,，將會影響它的性能,。

6）血清的熱滅活在免疫分析時可以滅活補體系統(tǒng)。在免疫學(xué)研究,，培養(yǎng)ES細(xì)胞,，昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時，推薦使用熱滅活血清,。熱滅活是以往*的操作步驟,，并沒有確鑿的證據(jù)說明這樣做是有益的。相反,，對大部分細(xì)胞而言,，GIBCO和HyClone都不推薦熱滅活血清。因為加熱可能使血清中的沉淀增加,，使您誤以為污染,。

7）在進(jìn)行傳代培養(yǎng)時，我們強烈推薦進(jìn)行臺盼蘭活性記數(shù),。研究者常常通過一個簡單的稀釋(1∶4或1∶2)進(jìn)行傳代,，不進(jìn)行活性檢測，您可能接種比你認(rèn)為的低得多的濃度的細(xì)胞,，這常?？赡軐?dǎo)致生長緩慢或培養(yǎng)物根本不生長。

8）在訂購的細(xì)胞到達(dá)后,，應(yīng)立即復(fù)蘇,，如果培養(yǎng)基還沒有準(zhǔn)備好，可將其放入液氮中,，盡快復(fù)蘇,。千萬不能放置在-20或-80℃的冰箱內(nèi)。

9）細(xì)胞復(fù)蘇往往是比較容易出問題的步驟,。請在訂購細(xì)胞時就向供應(yīng)商索取詳細(xì)的復(fù)蘇步驟,，并仔細(xì)閱讀。有些供應(yīng)商就不推薦在復(fù)蘇時離心,，對此類細(xì)節(jié),，應(yīng)特別留意。

10）如何避免血清中沉淀物的產(chǎn)生?

A) 解凍血清時,，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫),，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，實驗顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物,。并隨時將之搖晃均勻,，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生,。

B) 請勿將血清置于37℃太久,。若在37℃放置太久，血清會變得混濁,，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害,，而影響血清的質(zhì)量。

C) 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多,，若非必要,，可以無須做此步驟。

D) 若必須做血清的熱滅活,，請遵守56℃,，30min的原則，并且隨時搖晃均勻,。溫度過高,，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多,。

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外泌體（Exsome）發(fā)展歷程：

外泌體的發(fā)現(xiàn)要追溯到1986年,，Eberhard G. Trams和R.M.Johnstone在體外培養(yǎng)的綿羊紅細(xì)胞培養(yǎng)液上清中發(fā)現(xiàn)了一種有膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，并將其命名為Exosome（外泌體）,。隨后的10年,，外泌體并未受到足夠的重視。直至1996年,，G.Raposo發(fā)現(xiàn)類似于B淋巴細(xì)胞能分泌抗原提呈外泌體,，這種外泌體攜帶MHC-Ⅱ類分子、共刺激因子和粘附因子,。研究表明這種B細(xì)胞來源的外泌體可以直接刺激效應(yīng)CD4+細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng),。1998年，L.Zitvogel等發(fā)現(xiàn)樹突細(xì)胞（DC cell）也能產(chǎn)生有抗原提呈能力的外泌體,，而且外泌體含有功能性的MHC-Ⅰ類和Ⅱ類分子,，還有共刺激因子。這種外泌體啟動了特異性的CTL殺傷作用,，促進(jìn)了T細(xì)胞依賴的抗腫瘤效應(yīng),。

2007年，H.Valadi等發(fā)現(xiàn),，細(xì)胞之間可以通過外泌體中的RNA來交換遺傳物質(zhì),。這意味著細(xì)胞可以通過外泌體影響另外一個細(xì)胞，甚至可以把自己的基因強加給另外一個細(xì)胞,。研究人員逐漸對小小的外泌體產(chǎn)生了極大的好奇,。他們發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的外泌體與正常細(xì)胞的外泌體之間存在差異,，腫瘤的外泌體會促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,，腫瘤周圍組織細(xì)胞分泌的外泌體具備殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，等等,。2013年的諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎頒給了三位科學(xué)家,，他們分別是美國科學(xué)家James E. Rothman和Randy W. Schekman，德國科學(xué)家Thomas C. Südhof，以表彰他們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)部囊泡（外泌體等）運輸調(diào)控機制,。使外泌體的研究達(dá)到全新的高度,。就外泌體的研究方向而言，干細(xì)胞,、免疫,、microRNA,、靶向給藥,、癌癥的診斷及治療等都是熱門研究領(lǐng)域。

2015年JHuan等人證實了急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）的外泌體在白血病的骨髓微環(huán)境中具有抑制造血干細(xì)胞的功能,。同年WANGY等人發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞的外泌體可以在心肌細(xì)胞受到急性心肌缺血（MIR）影響時，給心肌細(xì)胞傳送保護(hù)信號,。

目前,，已有越來越多的學(xué)者開始關(guān)注外泌體在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用及其機制，外泌體將在癌癥的診斷及治療等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用,。2015年德克薩斯大學(xué)MD安德森癌癥中心的一項研究在6月24日的《自然》（Nature）雜志上發(fā)布,，研究發(fā)現(xiàn)存在于癌癥外泌體（exosomes）上的glypican-1 (GPC1)基因編碼蛋白，或許可以作為一種潛在非侵入性診斷和篩查工具的組成部分,，用來檢測有可能尚處于適合手術(shù)治療階段的早期胰腺癌,。研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌小鼠模型還未顯示出MRI可以檢測到的胰腺疾病跡象之時,，GPC1+ crExos就檢測到了胰腺癌的可能性,。相比常用的CA 19-9生物標(biāo)志物，GPC1+ crExos似乎是一種更可靠的篩查工具,。

“不同于循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)需要大量的新鮮血液,，在大約30年前保存到冷凍庫的血液樣本中也可以檢測和分離出GPC1+ crExos?？梢詮膬Υ鏄颖痉蛛x出的癌癥外泌體中提取出DNA,、RNA和蛋白質(zhì)，用于進(jìn)一步的遺傳和生物分析,。因此,，癌癥外泌體不僅僅是一種生物標(biāo)記物，分離出它們還可為我們提供一個癌癥特異性信息的寶庫,。”由于胰腺癌確診時常常已到晚期,，只有15%的患者適合于接受手術(shù)。如果能夠早期檢測到癌癥,，就可以采用胰十二指腸切除術(shù)來治療胰腺癌患者,。

目前有關(guān)外泌體的研究，主要集中在外泌體顆粒的提取、純化和內(nèi)容物分析上,。其中,，外泌體的粒徑表征和濃度信息是極為重要的參數(shù)。

外泌體的分離

目前,，外泌體的分離多采用超速離心,、磁珠免疫捕獲、沉淀或過濾三種方法,。

超速離心：耗時耗力,，往往需要8-30個小時；每次zui多只能處理6個樣品,；需要大量的起始材料,；產(chǎn)量不高。需一臺超速離心機,。

磁珠免疫捕獲：利用外泌體表面*的表面標(biāo)記物（如CD63,、CD9蛋白），用包被抗標(biāo)記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結(jié)合,，即可將外泌體吸附并分離出來,。磁珠法具有特異性高、操作簡便,、不影響外泌體形態(tài)完整等優(yōu)點,，但是效率低，外泌體生物活性易受pH和鹽濃度影響,，不利于下游實驗,，難以廣泛普及。

外泌體分離：

通過簡單離心,，從體液,、血液、尿液,、細(xì)胞中分離外泌體（Exosome）,，相比超速離心，安全,、快速,，經(jīng)過兩次柱子純化，很好的去除了白蛋白,，從而獲得高純度和高產(chǎn)量的外泌體,。

外泌體RNA/蛋白的分析

目前，通常使用組織診斷法進(jìn)行癌癥檢測,，如熒光原位雜交（FISH）和免疫組織化學(xué)（IHC）,。但是這樣基于組織診斷的方法具有很大的局限性,，因為需要較大量的組織樣本，其不能對癌癥變化進(jìn)行實時監(jiān)控,，不能準(zhǔn)確地反映當(dāng)前的疾病狀態(tài),。而外泌體診斷測試通過從尿液、血液和體液中提取的外泌體獲得遺傳信,。Exosomes是由所有含RNA,、DNA和蛋白的活細(xì)胞釋放的信使。因為Exosome包含來源于母細(xì)胞的信息,，因此在腫瘤學(xué)上,，基于外泌體的體液活檢對整個腫瘤活動提供了一個實時監(jiān)控并可對疾病的重要變化進(jìn)行檢測。

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