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液相色譜儀由高壓液體泵,、檢測器及液相色譜柱等三部分組成,，其中液相色譜柱的正確安裝和使用,，是液相色譜工作的關(guān)鍵；也是液相色譜工作者獲得正確可靠的實驗數(shù)據(jù)的必經(jīng)之路,。一、液相色譜柱的安裝：
1、液相色譜柱的結(jié)構(gòu)：
a,、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成,。
柱接頭采用低死體積結(jié)構(gòu),，柱接頭是兩端螺紋組件,，一端是為7/16英寸外螺紋，另一端是3／16英寸的內(nèi)螺紋(國內(nèi)外已規(guī)范化),。7／16英寸外螺紋與1／4英寸柱管(Φ6.35mm)連接,，中間放置壓壞用于密封。3／16英寸的內(nèi)螺紋與1／16英寸(Φ1.57mm)的連接管連接,，中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封,。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時,，用Φ1.57mm連接管通過空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底,，然后再擰緊空心螺釘。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上(連接管通過壓環(huán)后露出的管長度應(yīng)嚴(yán)格控制在2．5mm長或其他固定尺寸),。
在兩端柱接頭內(nèi),，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片(或濾網(wǎng))，用于封堵柱填料不被活動相沖出柱外而流失,?？罩鹘M件均為316#不銹鋼材質(zhì)，能耐受一般的溶劑作用,。但由于含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性,，故使用時要留意，柱及連接管內(nèi)不能長時間存留此類溶劑,，以避免腐蝕,。
b、柱填料：
液相色譜柱的分離作用是在填料與活動相之間進(jìn)行的,，柱子的分類是依據(jù)填料類型而定,。
正相柱：多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分為無定型和球型兩種,，其顆粒直徑在3-10 μm的范圍內(nèi),。另一類正相填料是硅膠表面鍵合-CN，-NH2等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠,。
反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì),，在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分,。
常用的其他的反相填料還有鍵合C8,、C4、C2,、苯基等,，其顆粒粒徑在3-10 μm之間。
2，色譜柱的安裝：
a,、拆開柱包裝盒,，確認(rèn)色譜柱的類型、尺寸,、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑,。
b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用,。
c,、 按柱管上標(biāo)示的活動相流向，將色譜柱的進(jìn)口端通過連接管與進(jìn)樣閥出口相連接(如條件答應(yīng),，建議在柱前使用保護(hù)柱),；柱的出口與檢測器連接。連接管是外徑為1.57mm,、內(nèi)徑為0.1-0.3mm的不銹鋼管,。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。在接管時一定要想法降低柱外死體積,。連接管通過空心螺釘,、壓環(huán)后盡量用力插到底，然后順時針擰緊空心螺釘,，直到擰不動為止，再用扳手繼續(xù)順時針擰1／4-1／2圈,，切記不要用力過大,。如色譜柱通過活動相加壓后有漏液現(xiàn)象，請用扳手繼續(xù)順時針擰1／4圈,，直至不漏液為止,。
二、液相色譜柱的使用：
色譜柱在使用前,，好進(jìn)行柱的性能測試,，并將結(jié)果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考,。但要留意：柱性能可能由于所使用的樣品,、活動相、柱溫等條件的差異而有所不同,；另外,，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進(jìn)行(出廠測試所使用的條件是佳條件)，只有這樣,，測得的結(jié)果才有可比性,。
1、樣品的前處理：
a,、好使用活動相溶解樣品,。
b,、使用予處理柱除往樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
c,、使用0.45μm的過濾膜過濾除往微粒雜質(zhì),。
2、活動相的配制：
液相色譜是樣品組分在柱填料與活動相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的,，因此要求活動相具備以下的特點：
a,、活動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保存在柱中),。
b,、活動相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外),。
c,、活動相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果,；同時降低柱壓降,，延長液體泵的使用壽命(可運用進(jìn)步溫度的方法降低活動相的黏度)。
1、液相色譜柱的結(jié)構(gòu)：
a,、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成,。
柱接頭采用低死體積結(jié)構(gòu),，柱接頭是兩端螺紋組件,，一端是為7/16英寸外螺紋，另一端是3／16英寸的內(nèi)螺紋(國內(nèi)外已規(guī)范化),。7／16英寸外螺紋與1／4英寸柱管(Φ6.35mm)連接,，中間放置壓壞用于密封。3／16英寸的內(nèi)螺紋與1／16英寸(Φ1.57mm)的連接管連接,，中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封,。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時,，用Φ1.57mm連接管通過空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底,，然后再擰緊空心螺釘。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上(連接管通過壓環(huán)后露出的管長度應(yīng)嚴(yán)格控制在2．5mm長或其他固定尺寸),。
在兩端柱接頭內(nèi),，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片(或濾網(wǎng))，用于封堵柱填料不被活動相沖出柱外而流失,?？罩鹘M件均為316#不銹鋼材質(zhì)，能耐受一般的溶劑作用,。但由于含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性,，故使用時要留意，柱及連接管內(nèi)不能長時間存留此類溶劑,，以避免腐蝕,。
b、柱填料：
液相色譜柱的分離作用是在填料與活動相之間進(jìn)行的,，柱子的分類是依據(jù)填料類型而定,。
正相柱：多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分為無定型和球型兩種,，其顆粒直徑在3-10 μm的范圍內(nèi),。另一類正相填料是硅膠表面鍵合-CN，-NH2等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠,。
反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì),，在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分,。
常用的其他的反相填料還有鍵合C8,、C4、C2,、苯基等,，其顆粒粒徑在3-10 μm之間。
2，色譜柱的安裝：
a,、拆開柱包裝盒,，確認(rèn)色譜柱的類型、尺寸,、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑,。
b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用,。
c,、 按柱管上標(biāo)示的活動相流向，將色譜柱的進(jìn)口端通過連接管與進(jìn)樣閥出口相連接(如條件答應(yīng),，建議在柱前使用保護(hù)柱),；柱的出口與檢測器連接。連接管是外徑為1.57mm,、內(nèi)徑為0.1-0.3mm的不銹鋼管,。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。在接管時一定要想法降低柱外死體積,。連接管通過空心螺釘,、壓環(huán)后盡量用力插到底，然后順時針擰緊空心螺釘,，直到擰不動為止，再用扳手繼續(xù)順時針擰1／4-1／2圈,，切記不要用力過大,。如色譜柱通過活動相加壓后有漏液現(xiàn)象，請用扳手繼續(xù)順時針擰1／4圈,，直至不漏液為止,。
二、液相色譜柱的使用：
色譜柱在使用前,，好進(jìn)行柱的性能測試,，并將結(jié)果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考,。但要留意：柱性能可能由于所使用的樣品,、活動相、柱溫等條件的差異而有所不同,；另外,，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進(jìn)行(出廠測試所使用的條件是佳條件)，只有這樣,，測得的結(jié)果才有可比性,。
1、樣品的前處理：
a,、好使用活動相溶解樣品,。
b,、使用予處理柱除往樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
c,、使用0.45μm的過濾膜過濾除往微粒雜質(zhì),。
2、活動相的配制：
液相色譜是樣品組分在柱填料與活動相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的,，因此要求活動相具備以下的特點：
a,、活動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保存在柱中),。
b,、活動相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外),。
c,、活動相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果,；同時降低柱壓降,，延長液體泵的使用壽命(可運用進(jìn)步溫度的方法降低活動相的黏度)。
| d,、活動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng),。如使用UV檢測器，好使用對紫外吸收較低的溶劑配制,。 e,、活動相沸點不要太低，否則輕易產(chǎn)生氣泡,，導(dǎo)致實驗無法進(jìn)行,。 f、在活動相配制好后,，一定要進(jìn)行脫氣,。除往溶解在活動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止活動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用,。 3,、活動相流速的選擇： 因柱效是柱中活動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效,。對于一根特定的色譜柱,，要追求佳柱效，好使用佳流速,。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱,，流速一般選擇1ml／min，對于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳,。 當(dāng)選用佳流速時,，分析時間可能延長?？刹捎酶淖兓顒酉嗟南礈鞆?qiáng)度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時,，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。 留意： a．由于甲醇廉價,，對于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場合除外),。 b．對于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作活動相，沒有提純的己烷不得使用,。用水好使用超純水(電阻率大于18兆歐),，往離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果,。 c．含水活動相奸在實驗前配制,，尤其是夏天使用緩沖溶液作為活動相不要過夜。好加進(jìn)*,，防止細(xì)菌生長,。 d．活動相要求使用0.45 μm濾膜過濾，除往微粒雜質(zhì),。 e．使用HPLC級溶劑配制活動相,，使用合適的活動相可延長色譜柱的使用壽命，進(jìn)步柱性能,。 4,、柱性能測試： 啟動液相色譜儀： a、活動相流速設(shè)定為1ml／min,。 b、UV檢測器波長設(shè)定為254nm,。 使用出廠測試時使用的活動相組成及測試樣品,。 記錄并計算測試結(jié)果。 *參考(標(biāo)準(zhǔn)JB5226-91)液相色譜儀測試用標(biāo)準(zhǔn)色譜柱,。 | |
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