透射熒光顯微鏡與反射熒光顯微鏡的區(qū)別及優(yōu)缺點(diǎn)
1.透射式熒光顯微鏡:激發(fā)光源是通過(guò)聚光鏡穿過(guò)標(biāo)本材料來(lái)激發(fā)熒光的,。常用暗視野集光器,,也可用普通集光器,調(diào)節(jié)反光鏡使激發(fā)光轉(zhuǎn)射和旁射到標(biāo)本上.這是比較舊式的熒光顯微鏡,。其優(yōu)點(diǎn)是低倍鏡時(shí)熒光強(qiáng),而缺點(diǎn)是隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱.所以對(duì)觀(guān)察較大的標(biāo)本材料較好,。
2.落射式熒光顯微鏡:這是近代發(fā)展起來(lái)的新式熒光顯微鏡,,與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面,即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡,。光路中需加上一個(gè)雙色束分離器,,它與光鈾呈45度角,激發(fā)光被反射到物鏡中,,并聚集在樣品上,,樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時(shí)進(jìn)入物鏡,,反回到雙色束分離器,,使激發(fā)光和熒光分開(kāi),殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收,。如換用不同的激發(fā)濾片/雙色束分離器/阻斷濾片的組合插塊,,可滿(mǎn)足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是視野照明均勻,成像清晰,,放大倍數(shù)愈大熒光愈強(qiáng),。
透射熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)
光源:高壓汞燈或鹵素?zé)簟?/p>
聚光鏡:使用暗場(chǎng)聚光鏡,使激發(fā)光和熒光分離出來(lái),。
物鏡:可用任何種類(lèi)的物鏡,。
標(biāo)本:因?yàn)槭峭干溆^(guān)察,薄的標(biāo)本比較適合,。
優(yōu)點(diǎn):①由于用了暗場(chǎng)聚光鏡,,激發(fā)光不能進(jìn)入物鏡,因此容易形成暗的背景,,得到良好的反差,,且任何物鏡都可用于觀(guān)察。②用低倍物鏡時(shí),,比反射熒光顯微鏡更亮,。
缺點(diǎn):必須正確調(diào)整聚光鏡中心和高度,否則不能獲得明亮的熒光像,。由于暗視場(chǎng)聚光鏡焦距限制,,不能使用厚的載玻片。視場(chǎng)照明區(qū)不能過(guò)大,,否則容易使熒光標(biāo)本熒光色衰褪,。厚的或不透明的標(biāo)本不適用。
反射熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)
光源:高壓汞燈或鹵素?zé)簟?/p>
聚光鏡:因?yàn)槲镧R作為聚光鏡,,所以不需要聚光鏡,。
物鏡:所用物鏡必須能透過(guò)足夠的紫外光,而且本身不產(chǎn)生熒光,,對(duì)數(shù)值孔徑?jīng)]有限制,。
標(biāo)本:厚的標(biāo)本或不透明的標(biāo)本都能觀(guān)察。
優(yōu)點(diǎn):①由于物鏡兼作聚光鏡,,不需要很多調(diào)節(jié),。②采用柯拉照明法,可利用孔徑光闌和視場(chǎng)光闌的效果,。③物鏡數(shù)值孔徑不受限制,,在高放大倍率時(shí),也可以獲得高分辨率的像,。④厚的或不透明的標(biāo)本也能觀(guān)察,,厚的蓋玻片也能使用。⑤其它觀(guān)察法也能與反射熒光結(jié)合使用,,特別和相差法和透射微分干涉差法相結(jié)合,。⑥可以避免不必要的熒光色衰褪現(xiàn)象,。
缺點(diǎn):在用地倍率物鏡時(shí),像比較暗,,因此必須用大數(shù)值孔徑的物鏡,。濾光鏡系統(tǒng)必須有效地分離開(kāi)激發(fā)光和熒光。
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