這些問(wèn)題才是導(dǎo)致 ELISA 測(cè)定結(jié)果出錯(cuò)的元兇,?
ELISA 即酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),,是一種常用的固相酶免疫測(cè)定方法,。Engvall 和 Perlmann 于 1971 年zui先應(yīng)用該法進(jìn)行了 IgG 定量測(cè)定,,并命名為"enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)",。 ELISA 的基本原理是:
①使抗原(或抗體)結(jié)合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性,;
②使抗原(或抗體)與某種酶聯(lián)結(jié)成酶標(biāo)抗原(或抗體),,而且此酶標(biāo)抗原(或抗體)既保留其免疫活性,又保留其酶活性,;
③ 測(cè)定時(shí)將受檢標(biāo)本(抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原(或抗體)按不同步驟與固相載體表面的抗原或抗體進(jìn)行反應(yīng),,再用洗滌方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其 它物質(zhì)分開(kāi),zui后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢的抗體或抗原量成一定比例,;再加入酶反應(yīng)底物后,,底物被酶催化后變?yōu)橛猩a(chǎn)物,根據(jù)其顏色反應(yīng)的深淺 進(jìn)行定性或定量分析,,以了解被測(cè)標(biāo)本中抗體或抗原含量,。
ELISA 方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定。但 ELISA 測(cè)定中影響因素較多,,而且其操作中有一定的技術(shù)要求,,在臨床檢驗(yàn)中除正常反應(yīng)外,有時(shí)??梢?jiàn)到一些錯(cuò)誤結(jié)果(即假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果),。引起 ELISA 測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有:
①標(biāo)本因素,;
②試劑因素;
③操作因素,。
本文就標(biāo)本因素對(duì) ELISA 測(cè)定的影響做如下討論,。
血清是zui常用的 ELISA 標(biāo)本,血漿一般可視為與血清同等的標(biāo)本,,標(biāo)本引起的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果主要是干擾性物質(zhì)所致,分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)兩種:
1. 內(nèi)源性物質(zhì)
有人認(rèn)為大約 40% 的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì),,可以不同程度影響檢測(cè)結(jié)果,。常見(jiàn)的干擾物質(zhì)有:類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體,、嗜異性抗體,、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠 Ig (s) 抗體,、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等,。
(1)類風(fēng)濕因子
人血清中 IgM、IgG 型類風(fēng)濕因子(RF)可以與 ELISA 系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標(biāo)記二抗的 FC 段直接結(jié)合,,從而導(dǎo)致假陽(yáng)性,。
解決該情況的辦法有:
①用 F(ab)2 替代完整的 IgG;
②標(biāo)本用聯(lián)有熱變性(63℃,,10 min)IgG 的固相吸附劑處理(將熱變性 IgG 加入到標(biāo)本稀釋液中同樣有效),;③檢測(cè)抗原時(shí),可以用 2-巰基乙醇等加入到標(biāo)本稀釋液中,,使 RF 降解,。
(2)補(bǔ)體 ELISA 系統(tǒng)中固相一抗和標(biāo)記二抗過(guò)程中,抗體分子發(fā)生變構(gòu),,其 FC 段的補(bǔ)體 C1q 分子結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來(lái),,使 C1q 可以將二者連接起來(lái),從而造成假陽(yáng)性,。解決的辦法是:①用 EDTA 稀釋標(biāo)本,;②用 53℃,10 min 或 56℃,,30 min 加熱血清使 C1q 滅活,。
(3)嗜異性抗體 人類血清中含有能與嚙齒類動(dòng)物(如鼠等)Ig (s) 結(jié)合的天然嗜異性抗體,可將 ELISA 系統(tǒng)中一抗和二抗連接起來(lái),,也能造成假陽(yáng)性,。解決的辦法是:可在標(biāo)本稀釋液中加入過(guò)量的動(dòng)物 Ig (s) ,但加入量不足或亞類不同時(shí)無(wú)效,。
(4)嗜靶抗原的自身抗體 抗甲狀腺球蛋白,、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體,,有時(shí)能與靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物,在 ELISA 方法中均可干擾抗原抗體測(cè)定結(jié)果,。為避免以上情況出現(xiàn),,解決的辦法是:測(cè)定前需用理化方法將其解離后再測(cè)定。
(5)醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠 Ig (s) 抗體 臨床開(kāi)展的用鼠源性 CD3 等單克隆抗體治療,,用放射性同位素標(biāo)記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術(shù),,均有可能使這些病人體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體;另外,,被 鼠等嚙齒類動(dòng)物咬傷的病人體內(nèi)也可以產(chǎn)生抗鼠 Ig (s) 抗體,。這些病人 ELISA 測(cè)定時(shí)均可產(chǎn)生假陽(yáng)性。解決的辦法是:測(cè)定抗原時(shí),,在標(biāo)本中加入足量的正常鼠 Ig (s) ,,從而克服由于上述原因造成的假陽(yáng)性。
(6)交叉反應(yīng)物質(zhì) 類地高辛,、類 AFP 樣物質(zhì)等,,是與靶抗原有交叉反應(yīng)的物質(zhì)。在用多抗測(cè)定抗原時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大,,但在用單克隆抗體測(cè)定抗原時(shí),,如果交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對(duì)應(yīng)的靶決定簇時(shí),也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果,。
(7)標(biāo)本中其它成分的影響 血清脂質(zhì)過(guò)高,、膽紅素、血紅蛋白及血液粘度過(guò)大等,,均對(duì) ELISA 測(cè)定結(jié)果有干擾作用,。
2. 外源性物質(zhì)
外源性物質(zhì)常常是由于用于 ELISA 測(cè)定的血標(biāo)本的采集、貯存等不當(dāng)所致,。如標(biāo)本溶血,、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存過(guò)久,、標(biāo)本凝集不全和采血管中添加物等影響,。
(1)標(biāo)本溶血 由于各種人為原因引起的標(biāo)本溶血,均可因紅細(xì)胞破壞溶解時(shí)釋放出大量具有過(guò)氧化物酶活性的血紅蛋白,,在以辣根過(guò)氧化物酶為標(biāo)記的 ELISA 測(cè)定中,,會(huì)導(dǎo)致非特異性顯色,干擾測(cè)定結(jié)果,。為克服上述干擾作用,,標(biāo)本采集時(shí)必須注意避免溶血。
(2)標(biāo)本受細(xì)菌污染 因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過(guò)氧化物酶,,因此,,被細(xì)菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣,,亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測(cè)定結(jié)果。
(3)標(biāo)本保存不當(dāng) 在冰箱中保存過(guò)久的標(biāo)本,,血清中 IgG 可聚合成多聚體,、AFP 可形成二聚體,在間接法 ELISA 測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深,、甚至造成假陽(yáng)性,;標(biāo)本放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(如一天以上),有時(shí)抗原或抗體免疫活性減弱,,亦可出現(xiàn)假陰性,。為克服上述干擾,ELISA 測(cè)定的血清標(biāo)本宜為新鮮采集,;如不能立即測(cè)定,5 天內(nèi)測(cè)定的血 清標(biāo)本可存放于 4℃,,1 周后測(cè)定的血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存,;凍存后融解的標(biāo)本,蛋白質(zhì)局部濃縮,,分布不均,,應(yīng)充分混合后再測(cè)定,但混勻時(shí)應(yīng)輕柔,,不可強(qiáng)烈振 蕩,。
(4)標(biāo)本凝集不全 在沒(méi)有促凝劑和抗凝劑存在的情況下,正常血液采集后 1/2~2 h 開(kāi)始凝固,,18~24 h *凝固,。臨床檢驗(yàn)工作中,有時(shí)為了爭(zhēng)取時(shí)間快速檢測(cè),,常在血液還 未開(kāi)始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清,,此時(shí)的血清中仍殘留部分纖維蛋白原,在 ELISA 測(cè)定過(guò)程中可以形成肉眼可見(jiàn)的纖維蛋白塊,,易造成假陽(yáng)性結(jié)果,;這類情況 于次日復(fù)查時(shí)因血凝已*,血清中不再有纖維蛋白原存在,,故復(fù)查結(jié)果變?yōu)殛幮?。為避免上述干擾作用,解決的辦法是血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再 分離血清,,或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?/span>
(5)標(biāo)本管中添加物質(zhì)的影響 抗凝劑(如肝素,,EDTA)、酶抑制劑(如 NaN3 可抑制 ELISA 系統(tǒng)中辣根過(guò)氧化物酶活性)及快速分離血清的分離膠等均對(duì) ELISA 測(cè)定有一定干擾作 用,。 綜上所述,,對(duì)臨床檢驗(yàn) ELISA 測(cè)定中出現(xiàn)的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果,,在考慮試劑因素和操作因素之外,更多的應(yīng)從標(biāo)本因素方面進(jìn)行分析,,并應(yīng)采取相應(yīng)措施排除 干擾作用,,從而為臨床提供正確可靠的檢測(cè)結(jié)果。
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