冰凍切片步驟

冰凍切片是一種在低溫條件下使組織快速冷凍到一定硬度,，然后進行切片的方法,，常用于臨床快速病理診斷。以下是基于最新信息的冰凍切片實驗步驟：

  1.組織取材：應盡可能快地采取新鮮的材料,，以防止組織發(fā)生死后變化,。

  2.組織速凍：將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)，如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織,，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi),，使組織迅速冰結成塊。

  3.組織固定：樣品托上涂一層OCT包埋膠,，將速凍組織置于其上，4℃冰箱預冷5-10分鐘讓OCT膠浸透組織,。

  4.切片：將冷凍的樣品置于含OCT復合物的低溫冷箱中,，采用標準的冷凍組織切片法。切片時,，低溫室內(nèi)溫度以-15℃至-20℃為宜,，溫度過低組織易破碎。

  5.切片后處理：切好室溫放置30分鐘后,，入4℃丙酮固定5-10分鐘,，烘箱干燥20分鐘。PBS洗5分鐘×3次,。

  6.染色：進行抗原熱修復,，微波熱修復也可，室溫自然冷卻,?？捎?%H2O2孵育5-10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,。

  7.免疫熒光染色：冰凍切片室溫晾干15分鐘,，用含10%正常山羊血清的PBS室溫封閉切片1小時，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液,，室溫孵育2小時或4℃過夜,。第二天回收一抗,，切片置于染缸內(nèi)，PBS洗5分鐘×3次,，滴加二抗孵育,，回收二抗后進行PBS洗，滴加DAPI工作液染核,，室溫10-20分鐘后封片,。

  8.切片保存：做好的切片放在切片盒內(nèi)，置于4℃冰箱,，可保存一周左右,。

在進行冰凍切片實驗時，應注意組織的溫度平衡,、切片機的設置,、載玻片的準備以及切片后的固定和染色步驟。這些步驟的優(yōu)化有助于獲得高質量的冰凍切片,，從而提高診斷的準確性.