平板克隆形成1基本原理
克隆形成試驗(yàn)是測定細(xì)胞增殖能力的有效方法之一,，貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆,，而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞,。細(xì)胞克隆形成率表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量，可以反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個(gè)重要性狀,。

所需材料· 細(xì)胞生長培養(yǎng)基

· 胎牛血清

· 胰蛋白酶

· PBS

·  青霉素-鏈霉素溶液（100X）

· 吉姆薩染液

3實(shí)驗(yàn)步驟1.取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞,，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，并把細(xì)胞懸浮在10%胎牛血清的細(xì)胞生長培養(yǎng)基中備用,。

2.將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋,，每組細(xì)胞每皿分別接種100個(gè)細(xì)胞于含10ml 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中,，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻,。

3.置37℃ 5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周,。

4.當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng),。棄去上清液,，用PBS小心浸洗2次。

5.加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml,，固定15分鐘,。

6.去固定液，加適量Giemsa應(yīng)用染色液染10～30分鐘

7.用流水緩慢洗去染色液,，空氣干燥,。

8.將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆,，或在顯微鏡（低倍鏡）計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù),。后計(jì)算克隆形成率。

克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%

9.平板克隆形成試驗(yàn)方法簡單,，適用于貼壁生長的細(xì)胞,。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿,。試驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度,。細(xì)胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán),，接種密度不能過大,。