研究背景：
結直腸癌是全球五大致命癌癥之一,，在中國是第二大常見惡性腫瘤,。肝轉(zhuǎn)移是患者預后不良的主要原因,，25%的患者初診時已有肝轉(zhuǎn)移,，
術后15%-25%因肝轉(zhuǎn)移復發(fā),，90%的肝轉(zhuǎn)移患者無法獲得有效治療,，IV期患者5年生存率僅24%。N-糖基化修飾在蛋白質(zhì)的多種功能中起關鍵作用,，
且與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移相關,，但目前關于結直腸癌肝轉(zhuǎn)移相關的N-糖基化蛋白質(zhì)組學研究較少。
研究方法：
收集14例結直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的原發(fā)性病灶和配對肝轉(zhuǎn)移病灶樣本,，經(jīng)處理后進行液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析,。對多種細胞系進行培養(yǎng)，
構建CTSD突變體,，通過轉(zhuǎn)染,、感染等操作，進行細胞增殖,、遷移,、侵襲、凋亡等實驗,。構建裸鼠皮下腫瘤和肝轉(zhuǎn)移模型,，觀察腫瘤生長和
轉(zhuǎn)移情況。
主要研究結果：
1. CRC患者肝轉(zhuǎn)移性病變表現(xiàn)出比原發(fā)性病變更高的CTSD N-糖基化水平
通過質(zhì)譜技術,，研究人員對比了14例原發(fā)性病灶和14例配對肝轉(zhuǎn)移病灶的N-糖基化修飾差異,，共檢測到139種N-糖基化蛋白、185個N -糖基化
修飾位點,、490個完整結構的N-糖肽以及71種糖基,。其中46個N-糖基化修飾位點此前未被Uniprot平臺報道。在肝轉(zhuǎn)移病灶中,，有13個位點的
N-糖基化修飾水平變化超過1.5倍,。N-糖基化位點周圍的氨基酸序列具有一定保守性,。44.94%的N-糖基化位點被單一、固定的糖基修飾,，
20.86%的N-糖蛋白含有多個N-糖基化修飾位點,。借助GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn),，這些N-糖基化蛋白可能屬于分泌蛋白和膜蛋白,。在生物學過程方面，
主要參與細胞間粘附,、蛋白水解和免疫反應等,；分子功能則主要與結合活性相關。KEGG通路富集分析表明,，它們可能涉及溶酶體,、
細胞外基質(zhì)-受體相互作用以及藥物-受體等相關途徑。此外,，在 Cathepsin D（CTSD）的第263位殘基處,，發(fā)現(xiàn) 2488.06545（PrecursorMH）
作為H (6) N (2) 糖基的結構修飾，在肝轉(zhuǎn)移病灶相對于原發(fā)性病灶的修飾變化倍數(shù)絕對值最高,。同時,，H (5) N (2)和H (7) N (2)的
N-糖基化修飾水平在肝轉(zhuǎn)移病灶中也顯著增加，這表明肝轉(zhuǎn)移病灶中CTSD第263位殘基的N-糖基化修飾水平整體高于原發(fā)性病灶,。
圖1結直腸癌原發(fā)性病灶和配對肝轉(zhuǎn)移病灶中N - 糖基化蛋白的相關分析
2. CTSD糖基化修飾特征及相關位點突變對蛋白的影響
對5例CRC患者的原發(fā)性病灶和配對肝轉(zhuǎn)移病灶進行檢測,，發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移病灶中CTSD的N -糖基化水平高于原發(fā)性病灶。同時,，
在多種CRC細胞系中評估CTSD的糖基化水平,，CTSD在不同CRC細胞系中的糖基化水平存在差異。使用PNGase F和衣霉素處理細胞系后,，
CTSD 的分子量下降,，表明CTSD存在N-糖基化修飾，且經(jīng)處理后從糖基化形式轉(zhuǎn)變?yōu)榉翘腔问?。分析發(fā)現(xiàn)CTSD在
天冬酰胺殘基 263（N263）處具有進化保守性,。UniProt 蛋白數(shù)據(jù)庫預測CTSD有2個潛在N-糖基化位點（天冬氨酸殘基134和263）。
隨后在SW480和 SW620 細胞系中沉默內(nèi)源性CTSD 表達,，再分別轉(zhuǎn)導編碼野生型 CTSD（CTSD WT）或突變型CTSD
（CTSD N263Q,、CTSD N134Q/N263Q）的外源質(zhì)粒，成功構建穩(wěn)定表達細胞模型,。通過對比突變前后及經(jīng) PNGase F 處理后的CTSD
分子量變化,，確定CTSD僅在殘基 134和263處存在N-糖基化修飾位點。
圖2 CTSD N-糖基化修飾位點驗證
3. CTSD N263位點糖基化修飾促進CRC生長和轉(zhuǎn)移
將CTSD野生型（WT）和N263Q突變型（非糖基化）的SW480細胞分別皮下注射至裸鼠,，成瘤實驗的結果表明CTSD WT組腫瘤體積顯著
大于N263Q組,，且腫瘤外觀更明顯,、重量更重。在肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型中,，WT組裸鼠肝臟表面可見明顯轉(zhuǎn)移結節(jié),，而N263Q組肝臟無肉眼可
見轉(zhuǎn)移灶；HE染色顯示WT組肝臟存在典型轉(zhuǎn)移灶,，N263Q組肝臟組織正常，無轉(zhuǎn)移跡象,，表明CTSD在N263位點的N -糖基化修飾是其
促進CRC生長和肝轉(zhuǎn)移的關鍵因素,，缺失該修飾（N263Q突變）會導致腫瘤增殖能力下降、皮下腫瘤生長速度顯著減慢,、轉(zhuǎn)移潛能喪失,。
圖3 CTSD N263位點糖基化修飾位點驗證對CRC生長和轉(zhuǎn)移的影響
4. CTSD N-糖基化修飾對其細胞定位、穩(wěn)定性及功能活性的影響
GeneCards顯示CTSD主要分布于細胞外基質(zhì),、溶酶體和內(nèi)體,。免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)野生型（WT）CTSD與溶酶體標記物LAMP1、早期
內(nèi)體標記物EEA1,、晚期內(nèi)體標記物Rab7共定位,，表明其正常運輸至溶酶體和內(nèi)體；而突變體（N263Q,、N134Q/N263Q）CTSD全喪失與
上述標記物的共定位能力,，滯留于細胞質(zhì)或錯誤定位。單突變體（N263Q）CTSD分泌量顯著低于WT細胞,，提示N263糖基化缺失抑制其分泌,；
而雙突變體（N134Q/N263Q）CTSD 分泌量反而高于WT細胞，表明雙位點糖基化缺失可能解除某種分泌抑制機制,。環(huán)己酰亞胺（CHX）
追蹤顯示WT CTSD在處理5小時后仍保持較高水平,，半衰期較長，N263Q 突變體CTSD在處理3小時后顯著降解,，半衰期縮短,。使用CTSD
特異性底物（GKPILFFRLK (Dnp)-D-R-NH2）和熒光法檢測發(fā)現(xiàn)，WT CTSD的酶活性顯著高于N263Q和N134Q/N263Q 突變體,，雙突變體
酶活性低,，單突變體次之，表明糖基化位點數(shù)量與酶活性呈正相關,。這表明N263糖基化是CTSD進入溶酶體/內(nèi)體的必要條件,，確保其在
酸性環(huán)境中發(fā)揮功能，糖基化抑制蛋白降解,，延長CTSD的半衰期,，并直接影響CTSD的催化效率,，促進其蛋白酶功能。此外,，N263位點在
定位和穩(wěn)定性調(diào)控中起主導作用,，而N134可能通過協(xié)同作用影響分泌和酶活。
圖4 CTSD第134和263位的N-糖基化調(diào)節(jié)其折疊位置,、穩(wěn)定性和功能活性
5. CTSD N-糖基化修飾的調(diào)控機制研究
隨后探究了 CTSD的N-糖基化修飾的調(diào)控機制,，重點鑒定了參與其糖基化的轉(zhuǎn)移酶復合體及關鍵亞基。利用FLAG標簽富集CTSD
野生型（WT）和N263Q突變體的互作蛋白,，通過質(zhì)譜分析差異結合蛋白,，發(fā)現(xiàn)CTSD WT特異性結合235種蛋白，N263Q結合191種蛋白,，
其中45種蛋白僅與WT互作，其中DDOST是唯的N -糖基轉(zhuǎn)移酶,。N -糖基化起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的寡糖轉(zhuǎn)移酶（OST）復合體,，分為OST-A
（催化亞基 STT3A）和OST-B（催化亞基STT3B），非催化亞基如DDOST可穩(wěn)定復合體與底物的結合,。隨后,，通過CPTAC數(shù)據(jù)庫
分析發(fā)現(xiàn)，STT3A,、STT3B和DDOST在結腸癌組織中均顯著高表達,，提示其與CRC進展相關。在SW480 細胞中敲除STT3B或DDOST后,，
CTSD分子量顯著降低,，表明N- 糖基化修飾缺失；而敲除STT3A無明顯變化,。免疫共沉淀驗證發(fā)現(xiàn),，CTSD WT與STT3B、DDOST
顯著互作,，而N263Q突變體與兩者的結合能力明顯減弱,，CTSD與STT3A無明顯結合，表明STT3B是主要催化亞基,。此外,，免疫熒光共
定位的結果表明CTSD與STT3B、DDOST在細胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)域顯著共定位,，而與STT3A無共定位,。
圖5 CTSD N-糖基轉(zhuǎn)移酶鑒定
6. CTSD的N-糖基化修飾通過降解ACADM、調(diào)控鐵死亡促進CRC肝轉(zhuǎn)移的分子機制
通過比較CTSD野生型（WT）和N263Q突變型SW480 細胞的蛋白質(zhì)組,，篩選鑒定出391個差異表達蛋白（DEPs）,，其中WT中高表達的蛋白
主要富集于蛋白酶活性,、細胞遷移等通路，N263Q中高表達的蛋白涉及脂肪酸代謝,、抗氧化反應等,，通過CTSD WT特異性互作蛋白與
DEPs的交集分析，初步篩選出8個候選分子：ACADM,、PRDX3,、ALDH2、EHHADH,、DHCR7,、TGFB1I1、IDH2,、ALDH1A1,。臨床
相關性分析顯示，ACADM和PRDX3高表達患者的預后顯著優(yōu)于低表達者,，提示兩者可能為抑癌因子,；TNM 分期分析發(fā)現(xiàn)ACADM表達隨
CRC惡性程度（TNM分期）進展而降低，在肝轉(zhuǎn)移（IV 期）患者中表達低,，表明 ACADM與轉(zhuǎn)移負相關,，因此選為后續(xù)研究靶點。
在CTSD WT和N263Q細胞中,，CTSD表達水平相當,，但N263Q細胞的ACADM蛋白水平顯著升高，提示CTSD糖基化促進 ACADM 降解,。
此外,，Co-IP的結果表明CTSD WT與ACADM顯著結合，而N263Q突變體無法與 ACADM互作,，表明CTSD的N263糖基化是其結合并降解
ACADM的前提,。最后，在90 例CRC組織中,，CTSD 表達與ACADM 呈顯著負相關,，且兩者在細胞質(zhì)中共定位，進一步驗證 CTSD 對
ACADM 的降解作用在臨床樣本中普遍存在,。
圖6 CTSD N263-糖基化修飾影響CTSD蛋白酶對ACADM的蛋白水解作用
研究結論：
本研究聚焦結直腸癌肝轉(zhuǎn)移中N-糖基化修飾機制,，CTSD的N263位點糖基化在肝轉(zhuǎn)移灶中顯著上調(diào)，該修飾由STT3B和DDOST糖基轉(zhuǎn)移酶
復合體調(diào)控,。CTSD糖基化通過維持其溶酶體定位,、穩(wěn)定性及蛋白酶活性，促進降解ACADM蛋白，進而調(diào)控鐵死亡相關蛋白（ACSL4,、
SLC7A11,、GPX4），增強CRC細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力,。體內(nèi)實驗顯示,，敲除N263 糖基化可抑制裸鼠腫瘤生長及肝轉(zhuǎn)移。該研究揭示CTSD-N263
糖基化通過“STT3B/DDOST-ACADM-鐵死亡軸" 驅(qū)動轉(zhuǎn)移,，為CRC治療提供了新靶點與理論依據(jù),。
研究思維導圖：
參考文獻：
Xiong N, Du Y, Huang C, Yan Q, Zhao L, Yang C, Sun Q, Gao Z, Wang C, Zhan J, Zhang H, Wang S, Ye Y, Li Y, Shen Z. N-glycosylation Modification of CTSD Affects Liver Metastases in Colorectal Cancer. Adv Sci (Weinh). 2025 Feb;12(7): e2411740. doi: 10.1002/advs.202411740. Epub 2024 Dec 24. PMID: 39716927; PMCID: PMC11831497.
