北京大學(xué)第三醫(yī)院在Molecular Cancer雜志發(fā)表的題為“Positive feedback regulation between glycolysis and histone lactylation drives oncogenesis in pancreatic ductal adenocarcinoma"的文獻(xiàn)。

胰腺癌是一種高度侵襲性的消化系統(tǒng)腫瘤,，是人類最致命的惡性腫瘤,，胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）占胰腺導(dǎo)管腺癌的80%以上,。代謝重編程和表觀遺傳改變誘導(dǎo)PDAC的侵襲性,。乳酸依賴性組蛋白修飾是一種新型的組蛋白標(biāo)記，該項(xiàng)研究深入探討了組蛋白乳酸化在PDAC進(jìn)展中的作用,，并通過(guò)H3K18la-TTK/BUB1B調(diào)控的表觀遺傳重編程將糖酵解和組蛋白乳酸化聯(lián)系起來(lái),，建立了糖酵解、組蛋白乳酸化和細(xì)胞周期基因的正反饋循環(huán),，增加了新的 PDAC機(jī)制,，為PDAC的治療策略設(shè)計(jì)提供線索。

乳酸化修飾作為近年來(lái)的研究熱點(diǎn),，其在生物學(xué)領(lǐng)域的重要性逐漸凸顯。達(dá)為科生物基于多年腫瘤領(lǐng)域的研究經(jīng)驗(yàn),，緊抓乳酸化修飾研究熱點(diǎn),，圍繞乳酸化修飾可從課題設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)規(guī)劃,、實(shí)驗(yàn)開(kāi)展等提供多樣化的服務(wù),，為您的科研之路保駕護(hù)航。

乳酸化修飾是2019年芝加哥大學(xué)趙英明教授課題組在Nature雜志shou次報(bào)道的全新蛋白質(zhì)翻譯后修飾類型(Ref:31645732; Nature; IF：69.5),，他shou次將組蛋白乳酸化修飾帶入我們的視野,。該項(xiàng)研究表明：代謝過(guò)程中積累的乳酸可以作為前體物質(zhì)導(dǎo)致組蛋白賴氨酸發(fā)生乳酸化修飾，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá),，并參與細(xì)菌感染的M1巨噬細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)調(diào)控,。乳酸通過(guò)介導(dǎo)乳酸化修飾，調(diào)控基因表達(dá)來(lái)發(fā)揮腫瘤代謝,、免疫等生物功能,。該研究不僅為蛋白質(zhì)的翻譯后修飾研究開(kāi)辟新的領(lǐng)域，也為代謝產(chǎn)物乳酸在腫瘤,、免疫等領(lǐng)域參與的研究提出了新方向,。

Figure 1 研究機(jī)制圖

研究框架

研究目的

乳酸依賴性組蛋白修飾是一種新型的組蛋白標(biāo)記，它將糖酵解代謝物與乳酸化修飾的表觀遺傳過(guò)程聯(lián)系起來(lái),。文章旨在討論組蛋白乳酸化PDAC進(jìn)展中的作用,。

研究方法

首先，通過(guò)Kaplan-Meier生存分析評(píng)估PDAC中組蛋白乳酸化水平和總生存期的關(guān)系,。其次,，在體內(nèi)外通過(guò)抑制組蛋白乳酸化（糖酵解抑制劑或乳酸脫氫酶A - LDHA 敲低）驗(yàn)證組蛋白乳酸化參與PDAC的進(jìn)展。隨后,，通過(guò)免疫印記及功能實(shí)驗(yàn)鑒定PDAC中組蛋白乳酸化的writers和erasers,，通過(guò)CUT&Tag和RNA-seq篩選得到H3K18，隨后通過(guò)ChIP-qPCR,，RT-qPCR和western blot 確定下游靶標(biāo)基因TTK和BUB1B,。后續(xù)通過(guò)過(guò)表達(dá)或基因敲低驗(yàn)證TTK和BUB1B在PDAC進(jìn)展中的作用,。最后通過(guò)Co-IP驗(yàn)證TTK與LDHA的相互作用，形成研究閉環(huán),。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為生命科學(xué)研究中的重要載體之一,，在很多領(lǐng)域的科學(xué)研究中，充當(dāng)著非常重要的安全試驗(yàn),、效果試驗(yàn),、標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)的角色，尤其在藥物有效性和安全性評(píng)價(jià)中發(fā)揮著不可huo缺的作用,。

達(dá)為科生物投資建立的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,，擁有清潔級(jí)、SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,，面積約1800平米,，中心員工包括獸醫(yī)、技術(shù)員和動(dòng)物飼養(yǎng)員,，所有員工擁有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上崗證,，有著深厚的專業(yè)背景和豐富的實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn)，可獨(dú)立開(kāi)展包括大小鼠,、裸鼠,、豚鼠、兔,、比格犬,、羊、小型豬等常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的動(dòng)物飼養(yǎng),、造模及相關(guān)實(shí)驗(yàn),。

研究結(jié)果

組蛋白乳酸化水平在PDAC中升高，H3K18乳酸化（H3K18la）水平升高與PDAC不良預(yù)后相關(guān),。糖酵解活性的抑制是PDAC體內(nèi)外抗腫瘤作用的重要機(jī)制,。E1A結(jié)合蛋白p300和組蛋白去乙酰化酶2分別是PDAC細(xì)胞中組蛋白乳酸化的潛在writers和erasers,。同時(shí),，H3K18la在TTK和BUB1B啟動(dòng)子處富集并促進(jìn)的轉(zhuǎn)錄。此外,，TTK和BUB1B可以提高P300的表達(dá),，從而增加糖酵解。另外TTK通過(guò)磷酸化LDHA Y239位點(diǎn)激活LDHA并進(jìn)一步促進(jìn)乳酸產(chǎn)生和H3K18乳酸化,。

研究結(jié)論

糖酵解- H3K18la - TTK/BUB1B正反饋循環(huán)促進(jìn)PDAC惡化,。這些研究結(jié)果對(duì)乳酸代謝重編程與表觀遺傳調(diào)控之間的相互關(guān)系進(jìn)行了新的探索，可能為PDAC治療中新的乳酸化治療策略提供依據(jù),。

結(jié)果解析

PDAC患者組蛋白乳酸化水平升高與不良預(yù)后相關(guān)

研究團(tuán)隊(duì)首先分析了PDAC組織及配對(duì)正常組織,、PDAC細(xì)胞系MIA PaCa-2,，PANC-1，AsPC-1,，PL45及人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系hTERT-HPNE中乳酸的水平,，發(fā)現(xiàn)PDAC組織/細(xì)胞系中的乳酸水平上調(diào)。在PDAC患者和健康組的血清樣本的非靶向代謝組學(xué)分析和KEGG富集分析表明血清差異代謝物富集在中心碳代謝途徑,。對(duì)PDAC組織及配對(duì)正常組織中蛋白乳酸化水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PDAC組織中泛賴氨酸乳酸化,，其中包括H3K18la。此外,，PDAC中H3K18la水平明顯上調(diào)并與晚期AJCC呈正相關(guān),。

糖酵解抑制減少組蛋白乳酸化并抑制PDAC細(xì)胞增殖和遷移

為了明確糖酵解對(duì)組蛋白乳酸化的影響，研究團(tuán)隊(duì)使用不同的糖酵解抑制劑和LDHA敲低干預(yù)PDAC細(xì)胞,，發(fā)現(xiàn)抑制劑干預(yù)減少泛賴氨酸乳酸化和H3K18la,，而siLDHA減少乳酸鈉誘導(dǎo)的組蛋白乳酸化水平。此外,，糖酵解抑制劑顯著抑制PDAC細(xì)胞活力和集落形成能力。siLDHA抑制PDAC細(xì)胞增殖和集落形成,，但其作用被乳酸鈉處理削弱,。另外，傷口愈合實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PDAC細(xì)胞的遷移能力表現(xiàn)出與增殖相同的趨勢(shì),。

糖酵解抑制減少組蛋白乳酸化并抑制PDAC異種移植小鼠模型中的PDAC進(jìn)展

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)組蛋白乳酸化在PDAC進(jìn)展中的生物學(xué)意義,，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步構(gòu)建PDAC異種移植小鼠模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在糖酵解抑制劑干預(yù)后或使用LDHA敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建動(dòng)物模型后,，腫瘤的生長(zhǎng),、乳酸含量、泛賴氨酸乳酸化,、H3K18la,、KI67表達(dá)及肝轉(zhuǎn)移灶形成受到顯著抑制。

P300和HDAC2分別是PDAC細(xì)胞中組蛋白乳酸化的潛在writer和eraser

隨后,，研究團(tuán)隊(duì)使用si-P300或P300抑制C646處理MIA PaCa-2細(xì)胞及AsPC-1細(xì)胞,，發(fā)現(xiàn)在乳酸鈉暴露條件下，si-P300 或 C646仍能顯著抑制泛賴氨酸乳酸化和H3K18la水平,。此外,，si-P300 或 C646可以顯著降低細(xì)胞增殖活力、集落形成能力以及細(xì)胞遷移能力,。另外,，乳酸鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移作用被si-P300 或 C646干預(yù)抑制。

H3K18la激活TTK和BUB1B的轉(zhuǎn)錄

為確定H3K18la如何影響PDAC進(jìn)展,，研究團(tuán)隊(duì)使用H3K18la抗體進(jìn)行CUT&Tag檢測(cè),。發(fā)現(xiàn)在糖酵解抑制劑干預(yù)后,，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）區(qū)域明顯減少而在啟動(dòng)子區(qū)域觀察到的富集。KEGG分析的結(jié)果表明RNA轉(zhuǎn)運(yùn)途徑,、細(xì)胞周期和腫瘤相關(guān)途徑存在相關(guān)富集,。RNA-seq并對(duì)糖酵解抑制劑干預(yù)后下調(diào)的基因進(jìn)行KEGG分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)主要富集在細(xì)胞周期相關(guān)過(guò)程中。

隨后,，通過(guò)在CUT&Tag,、RNA-seq和GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中重疊基因集，確定了14個(gè)差異表達(dá)基因,，這些基因在Oxamate處理后,，mRNA水平顯著降低，并在啟動(dòng)子區(qū)域表現(xiàn)出H3K18la富集的減少,。最終篩選得到周期相關(guān)的TTK和BUB1B基因,，并通過(guò)ChIP-qPCR進(jìn)一步驗(yàn)證H3K18la在TTK和BUB1B基因啟動(dòng)子區(qū)域的富集，但在糖酵解抑制劑干預(yù)后基因啟動(dòng)子區(qū)域的富集減少,。

高水平的TTK和BUB1B與PDAC的惡性表型相關(guān)

隨后,，研究團(tuán)隊(duì)探索了TTK和BUB1B在PDAC進(jìn)展中的作用。首先,，PDAC細(xì)胞系中TTK和BUB1B的mRNA和蛋白水平顯著高于人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系,。

其次，IHC分析顯示,，與癌旁組織相比,，PDAC組織中TTK和BUB1B的表達(dá)顯著增加。TTK或BUB1B高表達(dá)PDAC患者的總生存時(shí)間或無(wú)病生存時(shí)間比低表達(dá)者短,。此外,，TTK或BUB1B的敲低抑制PDAC細(xì)胞的增殖和遷移，而TTK過(guò)表達(dá)與糖酵解抑制劑共處理減弱了糖酵解抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的抑制作用,。

H3K18la靶基因與糖酵解之間的正反饋循環(huán)

在已報(bào)到的文章中,，BUB1B作為糖酵解代謝的激活劑促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生。因此,，研究團(tuán)隊(duì)推測(cè)在PDAC進(jìn)展中BUB1B具有同樣的功能并進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí),。研究結(jié)果表明siTTK與siBUB1B單獨(dú)或共處理均顯著下調(diào)P300蛋白水平。

隨后,，進(jìn)一步通過(guò)Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)結(jié)合LDHA抗體的IP 和結(jié)合TTK 抗體的western blot證實(shí)了TTK和 LDHA在PDAC細(xì)胞中存在相互作用,。敲低TTK顯著抑制LDHA Y239位點(diǎn)的磷酸化水平并下調(diào)LDH活力，減少乳酸生成,，降低了泛酪氨酸乳酸化和H3K18la的水平,。這些結(jié)果表明TTK在糖酵解和乳酸化之間起正反饋調(diào)控作用，并證實(shí)H3K18la/TTK/BUB1B與糖酵解/乳酸化之間的正反饋循環(huán)調(diào)控模式。

研究總結(jié)：

研究者shou次發(fā)現(xiàn)TTK敲低通過(guò)Y239磷酸化抑制LDHA的激活,。建立了糖酵解,、組蛋白乳酸化和細(xì)胞周期相關(guān)基因的正反饋循環(huán)。乳酸通過(guò)組蛋白乳酸化,，特別是H3K18la促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移,，而這一過(guò)程是由TTK和BUB1B介導(dǎo)的，進(jìn)而促進(jìn)糖酵解,，增加乳酸化,，誘導(dǎo)PDAC惡性表型。研究為代謝重編程表觀遺傳調(diào)控提供了新的探索和重要補(bǔ)充,，為理解PDAC的進(jìn)展機(jī)制提供新的思路,，也為PDAC的治療提供了新的線索。