一,、制備脾臟單細胞懸液

8周齡C57BL/6小鼠摘眼球放血,，無菌分離脾臟,，于70um濾網(wǎng)上研磨收集脾細胞，過濾,、離心,，再以RPMI-1640FD培養(yǎng)液重懸。

二,、磁珠標記

1. 細胞計數(shù)為8×10⁷/mL,。

2. 400×g離心4分鐘，去除上清,。

3.每10⁷個細胞總量使用40μL緩沖液重懸,。

4.每10⁷個細胞總量添加10μL CD8+T細胞生物素抗體混合物。

5.混勻,，4℃孵育 5分鐘,。

6.每10⁷個細胞加入2mL緩沖液洗滌細胞,，400×g離心4分鐘,，去上清。

7.每10⁷個細胞添加80μL 緩沖液,。

8.每10⁷個細胞添加20μL抗生物素磁珠,。

9.混勻，4℃孵育 10分鐘,。

三,、磁珠細胞分選  

1. 將LS分選柱置于相對應(yīng)的分選器中。

2. 用適當體積的緩沖液潤洗分選柱.

3. 將細胞懸液轉(zhuǎn)移至分選柱中,，收集含有未標記細胞的流出液,，即 CD8+T細胞。

4. 加適量的緩沖液,，收集總流出物,，并與步驟3中的流出液混合，這是CD8+T細胞,。

四,、流式鑒定

1. 將磁珠分選后得到的CD8+T細胞懸液離心，400 ×g,，4min,，棄去上清。

2. 細胞沉淀中加入1 mLFD培養(yǎng)基,，計數(shù),。

3. 從中取出兩份細胞（一份大概1×10⁶個細胞），設(shè)置為blank和CD8+T染色組。

4. CD8+T染色組加入200 μL流式染色緩沖液,，再加入5 μL Anti-Mo CD8a,，吹打均勻，常溫避光孵育15min,；

5. 孵育結(jié)束后,，PBS洗滌細胞，離心去上清,；

6. 加入200 μL流式染色緩沖液,，上機檢測。