1. SD大鼠,，250g,，通過(guò)頸椎脫位處死大鼠，浸入75%乙醇浸泡5分鐘,，轉(zhuǎn)移到通風(fēng)柜中的解剖盤中,。

2. 打開皮膚，暴露,、收集股骨,，無(wú)菌狀態(tài)下移除附著的肌肉和組織。

3. 并轉(zhuǎn)移股骨至預(yù)冷含雙抗的PBS中,，洗滌三次,。冰上操作。

4. 切斷股骨骨骺,， 使用5mlPBS,，1ml注射器針頭沖洗，沖洗液由棕色變成粉紅色即可（股骨變白）,。沖洗后,，用1ml注射器吹打3-5次。

5. 70um濾網(wǎng)過(guò)濾,，棄去篩網(wǎng),。使用 15ml 離心管，先加入分離液,，然后緩慢加入濾過(guò)的懸液,。20℃環(huán)境下，600g 離心 25min,。

6. 離心后,，離心管中液體由上至下分為四層,。第一層為稀釋液層,。第二層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層,。第四層為紅細(xì)胞層,。

7. 小心吸取離心管中的，環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層,，轉(zhuǎn)移到新離心管中,，加入 5-10ml 洗滌液,，混勻細(xì)胞。400g,，離心 10min,。

8. 棄去上清，用吸管吸取 5ml 清洗液重懸所得細(xì)胞,。 250g,，離心 10min，棄去上清,。 再用M199完丨全培養(yǎng)基（含10 ng/mL VEGF,，1 ng/mL b-FGF，1 ng/mL EGF,，20%胎牛血清,、1%雙抗）清洗一次，棄去上清,，M199完丨全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,。250g，離心 10min,，棄去上清,。M199完丨全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù),。

9. 按3×10⁶/孔種入纖連蛋白包被過(guò)的24孔板,，每3天換一次培養(yǎng)基，以去除非貼壁細(xì)胞,，持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3周,。