免疫熒光方法中的重要環(huán)節(jié):

1,、冰凍切片制備：

建議用新鮮組織，否則組織細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗原彌散,。選用干凈鋒利的刀片,、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴重,。

2,、組織切片固定：切好片風干后立即用冰丙酮等固定液進行固定5-10min，尤其要較長時間保存的白片,，一定要及時固定和適當保存,。

3、血清封閉：為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合,，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致）封閉,，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調(diào)整的,，一般10-30min,。

4、一抗孵育條件：在免疫組化反應(yīng)中最重要,，包括孵育時間和抗體濃度,。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫,、37度,，其中4度效果佳；孵育時間：這與溫度,、抗體濃度有關(guān),，一般37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min,。具體條件還要摸索,。

5、二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h,，具體時間需要摸索,，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度,，切記要避光反應(yīng),。但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間,。最后,，熒光素標記的二抗隨著保存時間的延長，可能后有大量的游離熒光素殘留,，需要注意配制時小包裝和并進行適當?shù)碾x心,。

6、復(fù)染：目的是形成細胞輪廓,，從而更好地對目標蛋白進行定位,。一般常用DAPI復(fù)染。

7,、封片：為了長期保存,，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液,。避免產(chǎn)生氣泡,，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角,，而另一手拿對面的那個拐角,，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止,；當發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時,，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產(chǎn)生氣泡,。

8,、切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色,，所以適當?shù)丶訌娗逑矗ㄑ娱L時間和增多次數(shù)）尤為重要,，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min,。注意（1）單獨沖洗,，防止交叉反應(yīng)造成污染。（2）溫柔沖洗,，防止切片的脫落,。我喜歡用浸洗方式；（3）沖洗的時間要足夠,，才能*洗去結(jié)合的物質(zhì),。（4）PBS的PH和離子強度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn),，當時我買的抗體稀釋液偏酸,，結(jié)果背景一片黃（未見特異性染色），建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M,。（中性及弱鹼性條件（PH7－8）有利于免疫復(fù)合物的形成,，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復(fù)合物的形成,，而高離子強度則有利于分解）

9,、拍照：有條件的話最好立即拍照,，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固,，保持避光和濕度,。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序,；應(yīng)在暗室中進行檢查,；防止紫外線對眼睛的損害，在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護眼鏡,；檢查時間每次以1~2h為宜,，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降,，熒光減弱,；標本受紫外線照射3~5min后，熒光也明顯減弱或褪色,；激發(fā)光長時間的照射,，會發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象；所以最多不得超過2~3h,；熒光顯微鏡光源壽命有限,，標本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時間,，保護光源,。天熱時，應(yīng)加電扇散熱降溫,，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時間,。燈熄滅后欲再啟用時，須待燈光充分冷卻后才能點燃,。一天中應(yīng)避免數(shù)次點燃光源,。關(guān)閉汞燈至少在開啟15-30分鐘后；標本染色后立即觀察,，因時間久了熒光會逐漸減弱,。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間,，防止封裱劑蒸發(fā),；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻,，無明顯的自發(fā)熒光,，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油,；電源最好裝穩(wěn)壓器,，否則電壓不穩(wěn)不僅會降低汞燈的壽命,，也會影響鏡檢的效果。