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液相色譜柱的操作及維護
閱讀：3323 發(fā)布時間：2014-2-25
液相色譜柱通常分為正相柱和反相柱,。正相柱大多以硅膠為柱，或是在硅膠表面鍵合-CN,-NH3等官能團的鍵合相硅膠柱,；反相柱填料主要以硅膠為基質(zhì),，在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團(ODS)稱為C18柱，其它常用的反相柱還有C8,C4,C2和苯基柱等,。另外還有離子交換柱,，GPC柱，聚合物填料柱等,。
一,、液相色譜柱的使用：
色譜柱在使用前，進(jìn)行柱的性能測試,，并將結(jié)果保存起來,，作為今后評價柱性能變化的參考。在做柱性能測試時要按照色譜柱出廠報告中的條件進(jìn)行(出廠測試所使用的條件是*條件),，只有這樣,，測得的結(jié)果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品,、流動相,、柱溫等條件的差異而有所不同。
1,、樣品的前處理
a,、使用流動相溶解樣品。
b,、使用預(yù)處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì),。
c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì),。
2,、流動相的配制
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：
a,、流動相對樣品具有一定的溶解能力,，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。
b,、流動相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)
c,、流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果,；降低柱壓降,，延長泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度),。
d、流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng),。如使用UV檢測器,，使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
e,、流動相沸點不要太低,，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實驗無法進(jìn)行,。
f,、在流動相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣,。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測,，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3,、流動相流速的選擇
因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效,。對于一根特定的色譜柱,，要追求*柱效，使用*流速,。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱,，流速一般選擇1ml／min，對于內(nèi)徑為4.0mm柱,，流速0.8ml／min為佳,。
當(dāng)選用*流速時，分析時間可能延長,?？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆姸鹊姆椒ㄒ钥s短分析時間(如使用反相柱時，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量),。
注意：
a．含水流動相在實驗前配制,，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜。加入*,，防止細(xì)菌生長,。
b．流動相要求使用0.45μm濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì),。
c．使用HPLC級溶劑配制流動相,，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能,。,、
二．色譜柱的維護：
1.色譜柱的平衡
反相色譜柱由工廠測試后是保存在乙腈/水中的,。新柱應(yīng)先使用10－20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱。請一定確保您分析樣品所使用的流動相和乙腈/水互溶,。每天用足夠的時間以流動相來平衡色譜柱,，您就會在處理問題方面獲得zui大的"補償"，而且您的色譜柱的壽命也會變得更長,！操作步驟：
a.平衡開始時將流速緩慢地提高,，用流動相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線(緩沖鹽或離子對試劑流速如果較低，則需要較長的時間來平衡)
b.如果使用的流動相中含有緩沖鹽,，應(yīng)注意用純水"過渡"即每天分析開始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動相平衡,；分析結(jié)束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護柱子。
2．色譜柱的再生
長期使用的色譜柱,，往往柱效會下降(柱子的理論塔板數(shù)減低),。可以對色譜柱進(jìn)行再生,，在有條件的實驗室應(yīng)使用一個廉價的泵進(jìn)行柱子的再生,。