基本信息

• 用途：主要用于體外定量檢測(cè)生物樣本中糖化血紅蛋白 A1c 的含量,，通常用于科研領(lǐng)域,，如糖尿病相關(guān)的基礎(chǔ)研究、藥物研發(fā)等,，而不能直接用于臨床診斷,。

• 適用樣本類型：常見的有血清、血漿,、細(xì)胞培養(yǎng)上清液,、組織勻漿、尿液,、分泌物等,。

檢測(cè)原理

• 雙抗體夾心法：以兔糖化血紅蛋白 A1c ELISA 試劑盒為例，用純化的糖化血紅蛋白 A1c 抗體包被微孔板,，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入糖化血紅蛋白 A1c，再與 HRP 標(biāo)記的糖化血紅蛋白 A1c 抗體結(jié)合,，形成抗體 - 抗原 - 酶標(biāo)抗體復(fù)合物,，經(jīng)過(guò)che底洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的糖化血紅蛋白 A1c 呈正相關(guān)，用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值）,，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中糖化血紅蛋白 A1c 濃度,。

• 競(jìng)爭(zhēng)法：如 Abbexa 公司的人糖化血紅蛋白 A1c ELISA 試劑盒，是基于競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù),。先將抗體預(yù)包被到 96 孔板上,，加入標(biāo)準(zhǔn)品、測(cè)試樣品和生*素標(biāo)記的試劑,，生*素標(biāo)記的糖化血紅蛋白 A1c 和未標(biāo)記的糖化血紅蛋白 A1c 會(huì)在包被抗體上發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)抑制反應(yīng),，再加入 HRP 標(biāo)記的試劑，孵育后洗去未結(jié)合的結(jié)合物,，加入 TMB 底物進(jìn)行顯色,，顏色變化與糖化血紅蛋白 A1c 的量成反比,，通過(guò)測(cè)定 OD 值計(jì)算糖化血紅蛋白 A1c 的濃度。

試劑盒組成

• 酶標(biāo)包被板：通常為 96 孔或 48 孔板,，表面預(yù)包被有特異性抗體,。

• 標(biāo)準(zhǔn)品：已知濃度的糖化血紅蛋白 A1c，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,，以便根據(jù)樣品的吸光度值計(jì)算其濃度,。

• 酶標(biāo)試劑：一般為 HRP 標(biāo)記的抗體或其他酶標(biāo)記的試劑，用于與抗原或抗體結(jié)合,，產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào),。

• 顯色劑：如 TMB 底物，在酶的作用下發(fā)生顏色變化,，用于指示反應(yīng)的結(jié)果,。

• 終止液：用于終止顯色反應(yīng)，使顏色穩(wěn)定,，便于測(cè)量吸光度,。

• 洗滌液：用于洗滌反應(yīng)板，去除未結(jié)合的物質(zhì),，減少非特異性結(jié)合的干擾,。

• 樣品稀釋液：用于稀釋樣品，使樣品中的糖化血紅蛋白 A1c 濃度在試劑盒的檢測(cè)范圍內(nèi),。

操作步驟

1. 試劑準(zhǔn)備：將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出,，在室溫平衡 15-30 分鐘。按照說(shuō)明書要求稀釋洗滌液,、配制酶標(biāo)工作液等,。

2. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測(cè)樣品孔,。在酶標(biāo)包被板上準(zhǔn)確加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻。

3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育一定時(shí)間,，使抗原與抗體充分結(jié)合,。

4. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干,，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復(fù)多次,，拍干,，以去除未結(jié)合的物質(zhì)。

5. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑,，空白孔除外,，然后進(jìn)行溫育。

6. 顯色：每孔先加入顯色劑 A,，再加入顯色劑 B,，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色一定時(shí)間,。

7. 終止：每孔加終止液,，終止反應(yīng)，此時(shí)顏色會(huì)發(fā)生變化,，如藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。

8. 測(cè)定：以空白孔調(diào)零,，在 450nm 波長(zhǎng)下依序測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）,，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中糖化血紅蛋白 A1c 的濃度。

注意事項(xiàng)

• 試劑盒保存：應(yīng)按照說(shuō)明書要求在 2-8℃條件下保存,，避免冷凍和反復(fù)凍融,，有效期一般為 6 個(gè)月左右。

• 操作規(guī)范：嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育,，所有試劑在使用前需達(dá)到室溫 20-25℃,。加樣要準(zhǔn)確，使用加樣器并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,，一次加樣時(shí)間最好控制在 5 分鐘內(nèi),。

• 避免污染：操作過(guò)程中要注意防止交叉污染，封板膜只限一次性使用,，不同批號(hào)的試劑組分不得混用,。

• 底物保存：底物顯色液應(yīng)避光保存，如發(fā)現(xiàn)底物液已經(jīng)變藍(lán)則不能使用,。