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一個(gè)月 |
應(yīng)用領(lǐng)域 |
化工,生物產(chǎn)業(yè),制藥/生物制藥 |
人可溶性腫瘤壞死因子α受體試劑盒,，用雙抗夾心 ELISA 法測(cè)人樣本中 sTNFαR,。操作含樣本準(zhǔn)備等多步,，各環(huán)節(jié)有要點(diǎn),，保障檢測(cè)精準(zhǔn)度,。
人可溶性腫瘤壞死因子α受體試劑盒
人可溶性腫瘤壞死因子α受體試劑盒,，英文名稱為 Human soluble Tumor Necrosis Factorαreceptor,，sTNFαR ELISA KIT，在醫(yī)學(xué)科研領(lǐng)域占據(jù)重要地位,，主要用于精準(zhǔn)測(cè)定人血清,、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清,、組織勻漿及其他相關(guān)液體樣本中可溶性腫瘤壞死因子 α 受體（sTNFαR）的含量 ,。對(duì) sTNFαR 含量的檢測(cè)，有助于深入探究人體免疫調(diào)節(jié)機(jī)制,、炎癥反應(yīng)過(guò)程以及相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理 ,。
一、檢測(cè)原理
該試劑盒普遍采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）原理 ,。在試劑盒所配備的酶標(biāo)板孔內(nèi),，提前包被有針對(duì)人 sTNFαR 的特異性抗體。當(dāng)開(kāi)展檢測(cè)工作時(shí),，將標(biāo)準(zhǔn)品與經(jīng)過(guò)預(yù)處理的待測(cè)樣本依次加入酶標(biāo)板孔中,。樣本里的 sTNFαR 會(huì)迅速與包被在孔壁上的特異性抗體特異性結(jié)合 。經(jīng)過(guò)一段適宜時(shí)間的溫育，確保結(jié)合反應(yīng)充分完成后,，通過(guò)洗滌操作去除未結(jié)合的雜質(zhì)以及其他干擾物質(zhì) ,。緊接著，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的另一種 sTNFαR 特異性抗體 ,。這種酶標(biāo)抗體能夠與已經(jīng)結(jié)合在包被抗體上的 sTNFαR 再次特異性結(jié)合,，從而形成 “包被抗體 - sTNFαR - 酶標(biāo)抗體" 的穩(wěn)定免疫復(fù)合物 。再次進(jìn)行洗滌步驟,，以徹di清除未參與反應(yīng)的多余酶標(biāo)抗體 ,。隨后，向各孔中添加底物 TMB,。在 HRP 的高效催化作用下,，原本無(wú)色的 TMB 底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，逐步轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色產(chǎn)物 ,。反應(yīng)持續(xù)一段時(shí)間后,，加入終止液，使反應(yīng)迅速停止,，此時(shí)溶液顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色 ,。由于溶液顏色的深淺程度與樣本中 sTNFαR 的含量呈正相關(guān)關(guān)系，借助酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)量各孔溶液的吸光度（OD 值）,，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的 OD 值繪制出精準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,，即可精確推算出待測(cè)樣本中 sTNFαR 的濃度 。
二,、操作步驟
樣本準(zhǔn)備：血清樣本采集后,，需在 1000×g 的條件下離心 10 分鐘，小心分離出血清,；血漿樣本同樣按此離心條件處理,，注意要依據(jù)不同抗凝劑要求規(guī)范采集；細(xì)胞培養(yǎng)上清液則需以 1000×g 離心 10 分鐘,，去除其中的細(xì)胞碎片和其他不溶性雜質(zhì),；組織勻漿要先將組織與適量生理鹽水混合，采用合適的勻漿方法制備,，再經(jīng) 1000×g 離心 10 分鐘,，取上清液備用 。若樣本不立即使用,，應(yīng)分成小份,，在 - 20℃或 -80℃環(huán)境下保存，防止反復(fù)凍融,，使用前需在室溫下緩慢充分解凍并確保均勻 ,。
試劑準(zhǔn)備：從冰箱取出試劑盒后，需將所有試劑在室溫下平衡 30 - 60 分鐘，使試劑溫度與室溫一致,，并充分混勻 。同時(shí),，依據(jù)實(shí)驗(yàn)所需檢測(cè)的樣本數(shù)量,，確定酶標(biāo)板的使用條數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)品孔和空白孔建議設(shè)置復(fù)孔,，以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性 ,。此外，要按照說(shuō)明書(shū)要求,，用蒸餾水將濃縮洗滌液準(zhǔn)確稀釋成工作洗滌液 ,。
加樣：在酶標(biāo)板上精確設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔與待測(cè)樣本孔,。向標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入 50μL 已稀釋好的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品,，濃度梯度需嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配置；待測(cè)樣本孔加入 50μL 處理好的樣本,；空白孔則不加任何試劑 ,。加樣時(shí)，務(wù)必使用微量加樣器,，并確保加樣量準(zhǔn)確,，將樣本或標(biāo)準(zhǔn)品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量避免觸及孔壁,，加樣后輕輕振蕩酶標(biāo)板,，使液體充分混勻 。
溫育與洗滌：加樣完成后,，用封板膜將酶標(biāo)板密封,，放置在 37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育相應(yīng)時(shí)間，具體溫育時(shí)長(zhǎng)參照試劑盒說(shuō)明書(shū) ,。溫育結(jié)束后,，小心揭去封板膜，甩去孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液,，振蕩 30 - 60 秒后，甩去洗滌液,，并用吸水紙拍干,，此洗滌操作需重復(fù) 4 - 5 次，以確保充分去除未結(jié)合物質(zhì) ,。若使用洗板機(jī)進(jìn)行洗滌,，需提前按照儀器操作規(guī)程進(jìn)行設(shè)置，且洗滌次數(shù)應(yīng)適當(dāng)增加 1 - 2 次 。
后續(xù)反應(yīng)與檢測(cè)：每孔加入 100μL HRP 標(biāo)記的檢測(cè)抗體,，輕輕振蕩混勻,，再次用封板膜密封，37℃溫育 30 分鐘 ,。溫育結(jié)束后,，重復(fù)上述洗滌步驟 。接著,，每孔依次加入底物 A,、B 各 50μL，輕輕振蕩混勻,，避免產(chǎn)生氣泡,，37℃避光顯色 15 - 20 分鐘 。顯色反應(yīng)結(jié)束后,，迅速向每孔加入 50μL 終止液,，加入終止液后應(yīng)立即使用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的 OD 值 。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,，計(jì)算出樣本中 sTNFαR 的濃度,，若樣本進(jìn)行過(guò)稀釋，還需乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)得到實(shí)際濃度 ,。
三,、注意事項(xiàng)
試劑盒中的所有試劑在使用前必須充分平衡至室溫，避免因溫度差異影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性 ,。同時(shí),，試劑使用后應(yīng)及時(shí)放回冰箱冷藏保存，防止試劑變質(zhì) ,。
樣本采集,、處理過(guò)程務(wù)必嚴(yán)格遵循規(guī)范操作，防止樣本受到污染或發(fā)生溶血,、脂血等情況,，以免干擾檢測(cè)結(jié)果 。如血清樣本應(yīng)避免溶血,，紅細(xì)胞溶解時(shí)釋放出的具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì),，可能會(huì)增加以 HRP 為標(biāo)記的 ELISA 測(cè)定中的非特異性顯色 。
洗滌過(guò)程至關(guān)重要,，既要確保充分去除雜質(zhì)和未結(jié)合物質(zhì),，又要避免過(guò)度洗滌導(dǎo)致已結(jié)合的物質(zhì)脫落 。洗滌液的配制應(yīng)準(zhǔn)確無(wú)誤,，洗滌次數(shù)和時(shí)間需嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行 ,。
加樣操作要精準(zhǔn),、迅速，盡量縮短各孔之間的加樣時(shí)間間隔,，保證實(shí)驗(yàn)條件的一致性 ,。使用加樣器時(shí)，需定期校準(zhǔn),，確保加樣量的準(zhǔn)確性 ,。
顯色反應(yīng)過(guò)程需嚴(yán)格控制時(shí)間和溫度，避免光線直射,，以保證顯色效果的穩(wěn)定性 。加入終止液后,，應(yīng)盡快進(jìn)行 OD 值測(cè)定,，一般建議在 15 分鐘以內(nèi)完成，防止結(jié)果出現(xiàn)偏差 ,。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的所有耗材,，如酶標(biāo)板、吸頭,、試管等,，應(yīng)確保無(wú)污染且質(zhì)量可靠，避免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響 ,。
若對(duì)檢測(cè)結(jié)果存在疑問(wèn)或出現(xiàn)異常情況,，應(yīng)及時(shí)檢查實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程、試劑狀態(tài)以及儀器性能等,，必要時(shí)可重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證 ,。
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