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一個月 |
應用領(lǐng)域 |
化工,生物產(chǎn)業(yè),制藥/生物制藥 |
人可溶性腫瘤壞死因子-1試劑盒,，借雙抗夾心 ELISA 法測樣本中 sTNF-1,。從樣本準備到結(jié)果測定，各環(huán)節(jié)嚴謹規(guī)范,，多要點保障檢測精準 ,。
人可溶性腫瘤壞死因子-1試劑盒
人可溶性腫瘤壞死因子-1試劑盒在醫(yī)學研究與臨床診斷中發(fā)揮著重要作用，主要用于精準檢測人血清,、血漿,、細胞培養(yǎng)上清液等樣本中可溶性腫瘤壞死因子 - 1（sTNF-1）的含量 。通過對 sTNF-1 含量的測定,，能為探究炎癥反應,、免疫調(diào)節(jié)以及相關(guān)疾病的發(fā)病機制提供關(guān)鍵依據(jù) 。
一,、檢測原理
該試劑盒通常采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）原理 ,。在試劑盒所配備的酶標板孔內(nèi)，預先包被有針對人 sTNF-1 的特異性捕獲抗體 ,。當進行檢測時,，將標準品與經(jīng)過妥善處理的待測樣本依次加入酶標板孔中 ,。樣本中的 sTNF-1 會迅速與包被在孔壁上的捕獲抗體特異性結(jié)合 。經(jīng)過一段適宜時間的溫育,，確保結(jié)合反應充分進行后,，通過洗滌操作去除未結(jié)合的雜質(zhì)以及其他干擾成分 。隨后,，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體 ,。該酶標抗體能夠與已經(jīng)結(jié)合在捕獲抗體上的 sTNF-1 再次特異性結(jié)合，從而形成 “捕獲抗體 - sTNF-1 - 酶標檢測抗體" 的穩(wěn)固免疫復合物 ,。再次進行洗滌,，以徹di清除未參與反應的多余酶標檢測抗體 。緊接著,，向各孔中添加底物 TMB ,。在 HRP 的高效催化作用下，原本無色的 TMB 底物發(fā)生化學反應,，逐步轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色產(chǎn)物 ,。反應持續(xù)一段時間后，加入終止液,，使反應迅速停止,，此時溶液顏色由藍色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色 。由于溶液顏色的深淺程度與樣本中 sTNF-1 的含量呈正相關(guān)關(guān)系,，借助酶標儀在 450nm 波長下測量各孔溶液的吸光度（OD 值）,，并依據(jù)標準品的 OD 值繪制出精準的標準曲線，即可精確推算出待測樣本中 sTNF-1 的濃度 ,。
二,、操作步驟
樣本準備：血清樣本采集后，需在 1000×g 的條件下離心 10 分鐘,，小心分離出血清,；血漿樣本同樣按此離心條件處理，注意要依據(jù)不同抗凝劑要求規(guī)范采集,；細胞培養(yǎng)上清液則需以 1000×g 離心 10 分鐘,，去除其中的細胞碎片和其他不溶性雜質(zhì) 。若樣本不立即使用,，應分成小份,，在 - 20℃或 -80℃環(huán)境下保存，防止反復凍融,，使用前需在室溫下緩慢充分解凍并確保均勻 ,。
試劑準備：從冰箱取出試劑盒后，需將所有試劑在室溫下平衡 30 - 60 分鐘,，使試劑溫度與室溫一致,，并充分混勻 ,。同時，依據(jù)實驗所需檢測的樣本數(shù)量,，確定酶標板的使用條數(shù),，標準品孔和空白孔建議設置復孔，以提高檢測結(jié)果的準確性與可靠性 ,。此外,，要按照說明書要求，用蒸餾水將濃縮洗滌液準確稀釋成工作洗滌液 ,。
加樣：在酶標板上精確設置標準品孔,、空白孔與待測樣本孔 。向標準品孔中加入 50μL 已稀釋好的不同濃度標準品,，濃度梯度需嚴格按照試劑盒說明書進行配置,；待測樣本孔加入 50μL 處理好的樣本；空白孔則不加任何試劑 ,。加樣時,，務必使用微量加樣器，并確保加樣量準確,，將樣本或標準品加于酶標板孔底部,，盡量避免觸及孔壁，加樣后輕輕振蕩酶標板,，使液體充分混勻 ,。
溫育與洗滌：加樣完成后，用封板膜將酶標板密封,，放置在 37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育相應時間,，具體溫育時長參照試劑盒說明書 。溫育結(jié)束后,，小心揭去封板膜,，甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液,，振蕩 30 - 60 秒后，甩去洗滌液,，并用吸水紙拍干,，此洗滌操作需重復 4 - 5 次，以確保充分去除未結(jié)合物質(zhì) ,。若使用洗板機進行洗滌,，需提前按照儀器操作規(guī)程進行設置，且洗滌次數(shù)應適當增加 1 - 2 次 ,。
后續(xù)反應與檢測：每孔加入 100μL HRP 標記的檢測抗體,，輕輕振蕩混勻,，再次用封板膜密封，37℃溫育 30 分鐘 ,。溫育結(jié)束后,，重復上述洗滌步驟 。接著,，每孔依次加入底物 A,、B 各 50μL，輕輕振蕩混勻,，避免產(chǎn)生氣泡,，37℃避光顯色 15 - 20 分鐘 。顯色反應結(jié)束后,，迅速向每孔加入 50μL 終止液,，加入終止液后應立即使用酶標儀在 450nm 波長處測定各孔的 OD 值 。依據(jù)標準曲線,，計算出樣本中 sTNF-1 的濃度,，若樣本進行過稀釋，還需乘以相應的稀釋倍數(shù)得到實際濃度 ,。
三,、注意事項
試劑盒中的所有試劑在使用前必須充分平衡至室溫，避免因溫度差異影響檢測結(jié)果的準確性 ,。同時,，試劑使用后應及時放回冰箱冷藏保存，防止試劑變質(zhì) ,。
樣本采集,、處理過程務必嚴格遵循規(guī)范操作，防止樣本受到污染或發(fā)生溶血,、脂血等情況,，以免干擾檢測結(jié)果 。如血清樣本應避免溶血,，紅細胞溶解時釋放出的具有過氧化物酶活性的物質(zhì),，可能會增加以 HRP 為標記的 ELISA 測定中的非特異性顯色 。
洗滌過程至關(guān)重要,，既要確保充分去除雜質(zhì)和未結(jié)合物質(zhì),，又要避免過度洗滌導致已結(jié)合的物質(zhì)脫落 。洗滌液的配制應準確無誤,，洗滌次數(shù)和時間需嚴格按照說明書執(zhí)行 ,。
加樣操作要精準、迅速,，盡量縮短各孔之間的加樣時間間隔,，保證實驗條件的一致性 ,。使用加樣器時，需定期校準,，確保加樣量的準確性 ,。
顯色反應過程需嚴格控制時間和溫度，避免光線直射,，以保證顯色效果的穩(wěn)定性 ,。加入終止液后，應盡快進行 OD 值測定,，一般建議在 15 分鐘以內(nèi)完成,，防止結(jié)果出現(xiàn)偏差 。
實驗過程中使用的所有耗材,，如酶標板,、吸頭、試管等,，應確保無污染且質(zhì)量可靠,，避免對實驗結(jié)果造成影響 。
若對檢測結(jié)果存在疑問或出現(xiàn)異常情況,，應及時檢查實驗操作過程,、試劑狀態(tài)以及儀器性能等，必要時可重復實驗進行驗證 ,。
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