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一個月 |
應(yīng)用領(lǐng)域 |
化工,生物產(chǎn)業(yè),制藥/生物制藥 |
人可溶性粘附分子sCD26試劑盒,，運(yùn)用雙抗夾心 ELISA 法檢測樣本 sCD26 含量。從樣本處理到讀數(shù)多環(huán)節(jié)嚴(yán)謹(jǐn)操作,，多項(xiàng)要點(diǎn)保障檢測精準(zhǔn) ,。
人可溶性粘附分子sCD26試劑盒
人可溶性粘附分子sCD26試劑盒在醫(yī)學(xué)科研與臨床檢測中具有重要意義，主要用于精準(zhǔn)定量測定人血清,、血漿,、細(xì)胞培養(yǎng)上清液及其他相關(guān)生物液體樣本中的可溶性粘附分子 sCD26 含量。sCD26 作為一種多功能蛋白,，在免疫調(diào)節(jié),、炎癥反應(yīng)以及腫瘤進(jìn)展等諸多生理病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，對其含量的準(zhǔn)確檢測為相關(guān)疾病的研究,、診斷及治療效果評估提供了有力依據(jù),。
一、檢測原理
該試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）原理,。在試劑盒配備的酶標(biāo)板孔內(nèi),，預(yù)先包被有針對人 sCD26 的特異性捕獲抗體。當(dāng)開展檢測時,，將標(biāo)準(zhǔn)品與經(jīng)過預(yù)處理的待測樣本依次加入酶標(biāo)板孔中,。樣本中的 sCD26 會迅速與包被在孔壁上的捕獲抗體特異性結(jié)合。經(jīng)過一段適宜時間的溫育,，確保結(jié)合反應(yīng)充分進(jìn)行后,，通過洗滌操作去除未結(jié)合的雜質(zhì)以及其他干擾物質(zhì),。隨后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體,，該抗體能夠與已經(jīng)結(jié)合在捕獲抗體上的 sCD26 再次特異性結(jié)合,，從而形成 “捕獲抗體 - sCD26 - 酶標(biāo)檢測抗體" 的穩(wěn)定免疫復(fù)合物。再次進(jìn)行洗滌,，以徹di清除未參與反應(yīng)的多余酶標(biāo)檢測抗體,。緊接著，向各孔中添加底物 TMB,。在 HRP 的高效催化作用下,，原本無色的 TMB 底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，逐步轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色產(chǎn)物,。反應(yīng)持續(xù)一段時間后,，加入終止液，使反應(yīng)迅速停止,，此時溶液顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色,。由于溶液顏色的深淺程度與樣本中 sCD26 的含量呈正相關(guān)關(guān)系，借助酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測量各孔溶液的吸光度（OD 值）,，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的 OD 值繪制出精準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,，即可精確推算出待測樣本中 sCD26 的濃度。
二,、操作步驟
樣本準(zhǔn)備：血清樣本采集后,，需在 1000×g 的條件下離心 10 分鐘，小心分離出血清,；血漿樣本同樣按此離心條件處理,，注意要依據(jù)不同抗凝劑要求規(guī)范采集；細(xì)胞培養(yǎng)上清液則需以 1000×g 離心 10 分鐘,，去除其中的細(xì)胞碎片和其他不溶性雜質(zhì),。若樣本不立即使用，應(yīng)分成小份,，在 - 20℃或 -80℃環(huán)境下保存,，防止反復(fù)凍融，使用前需在室溫下緩慢充分解凍并確保均勻,。
試劑準(zhǔn)備：從冰箱取出試劑盒后,，需將所有試劑在室溫下平衡 30 - 60 分鐘，使試劑溫度與室溫一致,，并充分混勻,。同時，依據(jù)實(shí)驗(yàn)所需檢測的樣本數(shù)量,，確定酶標(biāo)板的使用條數(shù),，標(biāo)準(zhǔn)品孔和空白孔建議設(shè)置復(fù)孔,，以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。此外,，要按照說明書要求,，用蒸餾水將濃縮洗滌液準(zhǔn)確稀釋成工作洗滌液。
加樣：在酶標(biāo)板上精確設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔,、空白孔與待測樣本孔。向標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入 50μL 已稀釋好的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品,，濃度梯度需嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行配置,；待測樣本孔加入 50μL 處理好的樣本；空白孔則不加任何試劑,。加樣時,，務(wù)必使用微量加樣器，并確保加樣量準(zhǔn)確,，將樣本或標(biāo)準(zhǔn)品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量避免觸及孔壁，加樣后輕輕振蕩酶標(biāo)板,，使液體充分混勻,。
溫育與洗滌：加樣完成后，用封板膜將酶標(biāo)板密封,，放置在 37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育相應(yīng)時間,，具體溫育時長參照試劑盒說明書。溫育結(jié)束后,，小心揭去封板膜,，甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液,，振蕩 30 - 60 秒后,，甩去洗滌液，并用吸水紙拍干,，此洗滌操作需重復(fù) 4 - 5 次,，以確保充分去除未結(jié)合物質(zhì)。若使用洗板機(jī)進(jìn)行洗滌,，需提前按照儀器操作規(guī)程進(jìn)行設(shè)置,，且洗滌次數(shù)應(yīng)適當(dāng)增加 1 - 2 次。
后續(xù)反應(yīng)與檢測：每孔加入 100μL HRP 標(biāo)記的檢測抗體,，輕輕振蕩混勻,，再次用封板膜密封，37℃溫育 30 分鐘,。溫育結(jié)束后,，重復(fù)上述洗滌步驟,。接著，每孔依次加入底物 A,、B 各 50μL,，輕輕振蕩混勻，避免產(chǎn)生氣泡,，37℃避光顯色 15 - 20 分鐘,。顯色反應(yīng)結(jié)束后，迅速向每孔加入 50μL 終止液,，加入終止液后應(yīng)立即使用酶標(biāo)儀在 450nm 波長處測定各孔的 OD 值,。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣本中 sCD26 的濃度,，若樣本進(jìn)行過稀釋,，還需乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)得到實(shí)際濃度。
三,、注意事項(xiàng)
試劑盒中的所有試劑在使用前必須充分平衡至室溫,，避免因溫度差異影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時,，試劑使用后應(yīng)及時放回冰箱冷藏保存,，防止試劑變質(zhì)。
樣本采集,、處理過程務(wù)必嚴(yán)格遵循規(guī)范操作,，防止樣本受到污染或發(fā)生溶血、脂血等情況,，以免干擾檢測結(jié)果,。如血清樣本應(yīng)避免溶血，紅細(xì)胞溶解時釋放出的具有過氧化物酶活性的物質(zhì),，可能會增加以 HRP 為標(biāo)記的 ELISA 測定中的非特異性顯色,。
洗滌過程至關(guān)重要，既要確保充分去除雜質(zhì)和未結(jié)合物質(zhì),，又要避免過度洗滌導(dǎo)致已結(jié)合的物質(zhì)脫落,。洗滌液的配制應(yīng)準(zhǔn)確無誤，洗滌次數(shù)和時間需嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行,。
加樣操作要精準(zhǔn),、迅速，盡量縮短各孔之間的加樣時間間隔,，保證實(shí)驗(yàn)條件的一致性,。使用加樣器時，需定期校準(zhǔn)，確保加樣量的準(zhǔn)確性,。
顯色反應(yīng)過程需嚴(yán)格控制時間和溫度,，避免光線直射，以保證顯色效果的穩(wěn)定性,。加入終止液后,，應(yīng)盡快進(jìn)行 OD 值測定，一般建議在 15 分鐘以內(nèi)完成,，防止結(jié)果出現(xiàn)偏差,。
實(shí)驗(yàn)過程中使用的所有耗材，如酶標(biāo)板,、吸頭,、試管等，應(yīng)確保無污染且質(zhì)量可靠,，避免對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響,。
若對檢測結(jié)果存在疑問或出現(xiàn)異常情況,，應(yīng)及時檢查實(shí)驗(yàn)操作過程,、試劑狀態(tài)以及儀器性能等，必要時可重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,。
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