英文品名:Kappa ELISA Kit

貨號:80722
廠商品牌:Crystalchem
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：
1.  試劑準(zhǔn)備：所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫,，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。  實(shí)驗(yàn)操作中請使用一次性的吸頭,，避免交叉污染。
2.   加樣：加樣或加試劑時,，請注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品,，酶結(jié)合物或底物時,，前一個孔與后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育"時間,，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時間(包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品)好控制在10分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用多道移液器加樣。
3.   孵育：為防止樣品蒸發(fā),，試驗(yàn)時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,，任何時侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài);同時應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的孵育時間和溫度,。
4.   洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干,，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印,，避免影響后的酶標(biāo)儀讀數(shù),。
5.  試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底,。標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。請確配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液,，盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10μl),，以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差,；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
6.  反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如,，每隔10分鐘),，如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),，避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù),。
7.  底物：底物請避光保存,，在儲存和溫育時避免強(qiáng)光直接照射。
   建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性?！　1. 液體培養(yǎng)基的保存是冷藏好,？還是冷凍好,？

　　要冷藏！,！因?yàn)橐后w培養(yǎng)基經(jīng)冷凍后再經(jīng)溶化時，其溶液的pH值會發(fā)生改變,，溶液往往變堿,，某些成分溶解也會受到影響對細(xì)胞生長不利,。故液體培養(yǎng)基一定要存放在冷藏箱中，通常液體培養(yǎng)基在冷藏條件下可存放6個月 ~ 一年,。

　　Q3.細(xì)胞計(jì)數(shù)及存活測試
1,、原理：
(1)計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤或是Coultercounter粒子計(jì)數(shù)器自動計(jì)數(shù),。
(2)血球計(jì)數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber中細(xì)刻9個1mm2大正方形,，其中4個角落之正方形再細(xì)刻16個小格,，深度均為0.1mm,。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml,。使用時,，計(jì)數(shù)每個大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目,，乘以稀釋倍數(shù),，再乘以104，即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目,。
(3)存活測試之步驟為dyeexclusion,，利用染料會滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整,，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍(lán)色之trypan blue染料,，如果細(xì)胞不易吸收trypan blue,，則用紅色之Erythrosin bluish。計(jì)算細(xì)胞活率：活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%,。計(jì)數(shù)應(yīng)在臺盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成，隨時間延長,，部分活細(xì)胞也開始攝取染料;因?yàn)榕_盼蘭對蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的親和力,，用不含血清的稀釋液,，可以使染色計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確,。

　　Q4.細(xì)胞特性
在細(xì)胞培養(yǎng)之前，我們要了解一下你所要養(yǎng)細(xì)胞的基本特性,，這點(diǎn)可以從細(xì)胞的產(chǎn)品說明書或者從ATCC細(xì)胞庫查詢,。除此之外我們還要知道每管細(xì)胞的數(shù)量，建議分裂或傳代的比例,，和已知細(xì)胞的傳代代次等信息。

　　Q5.準(zhǔn)備培養(yǎng)基
復(fù)蘇細(xì)胞時需要準(zhǔn)備合適的培養(yǎng)基,，血清和細(xì)胞生長所需的添加劑,。大部分培養(yǎng)細(xì)胞所用的培養(yǎng)體系,，可以在訂購細(xì)胞系時獲得。
雖然大多數(shù)細(xì)胞系可以在不止一種培養(yǎng)基中生長,，但是當(dāng)培養(yǎng)基改變時,，細(xì)胞的性質(zhì)也會變化,。因此,，使用細(xì)胞庫推薦的培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞會獲得的效果。

　　Q6.開啟凍存管
1.準(zhǔn)備一個培養(yǎng)瓶,，加入適宜細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基,，液體體積按照說明書的推薦配置，并平衡培養(yǎng)基的溫度和pH（CO2）,。　
2.在37℃水浴中或細(xì)胞的正常生長溫度下將凍存管輕輕搖動,。解凍要快,，約2分鐘或直到冰晶融化即可。
3.從水浴中取出凍存管并用浸泡或噴灑70%乙醇的方式來消毒,。進(jìn)一步的操作均需在無菌操作臺中嚴(yán)格無菌條件下進(jìn)行。
4.擰開凍存管的管帽并將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到一個含有9 ml推薦培養(yǎng)基的無菌離心管中,。通過溫和離心（125×g 10 min）除去冷凍保護(hù)劑（DMSO）,。棄去上清,，并用1或2 ml*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將這些細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含有*培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中并輕輕搖動以*混勻,。
5.培養(yǎng)24小時后檢查細(xì)胞狀態(tài)并在需要時進(jìn)行傳代。

　　Q7. 培養(yǎng)用液pH對細(xì)胞生長的影響

　　由于,，大多數(shù)細(xì)胞適宜pH為7.2~7.4,，偏離此范圍對細(xì)胞將產(chǎn)生有害的影響,。各種細(xì)胞對pH的要求也不*相同，原代培養(yǎng)細(xì)胞一般對pH變動耐受差,，無限細(xì)胞系耐受力強(qiáng)。但總體來說,，細(xì)胞耐酸性比耐堿性強(qiáng)一些,，偏酸環(huán)境中更利于細(xì)胞生長。因此,，我們在配制培養(yǎng)用液時，可把液體的pH稍微調(diào)得偏酸一些,。液體在經(jīng)過0.10um或0.22um濾膜過濾時,，溶液的pH還會向上浮動0.2左右,。