CD8+ CD8+細胞 atcc標準菌株
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基因敲除技術(shù)是20世紀80年代發(fā)展起來的，是建立在基因同源重組技術(shù)基礎(chǔ)以及胚胎干細胞技術(shù)基礎(chǔ)上的一種新分子生物學(xué)技術(shù),?；蚯贸褪峭ㄟ^同源重組將外源基因定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾改造染色體上某一基因的目的的一種技術(shù),。本文對三種基因敲除技術(shù)作比較,，描述它們的優(yōu)缺點。
基于胚胎干細胞的同源重組技術(shù)
1、優(yōu)勢：成熟,、可靠,、精細是目前為止*一個可以滿足所有要求的打靶技術(shù)
2、局限性：
A 需要ES細胞,，目前只有小鼠有的ES細胞,，其它模式動物的ESC還不能實現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用。
B 周期長,、工作量大,、費用相對比較高
3、可提供服務(wù)類型：
A 全基因敲除模式小鼠
B 條件性基因敲除模式小鼠
C 先全敲除再條件性敲除模式小鼠
D 基因敲入模式小鼠
E ROSA位點定點轉(zhuǎn)基因
TALEN技術(shù)
1,、優(yōu)勢：基因敲除效率高,，速度快，可實現(xiàn)多物種基因敲除
2,、局限性：
基因敲入效率較低,，多基因敲除困難，系統(tǒng)構(gòu)建相對復(fù)雜,，存在脫靶風(fēng)險
3,、可提供服務(wù)類型：
A 全基因敲除大/小鼠
B 全基因敲除細胞系
EGE系統(tǒng)
1、優(yōu)勢：基因敲除/敲入效率高,，速度快,，可實現(xiàn)多基因、多物種基因敲除/敲入,，系統(tǒng)構(gòu)建簡單
2,、局限性：
存在脫靶風(fēng)險，但通過選擇合適的sgRNA可以有效降低脫靶率,，In vivo脫靶可通過傳代去除.
3,、可提供服務(wù)類型：
A 全基因/條件性基因敲除大/小鼠
B 全基因/條件性報告基因敲除/敲入大/小鼠
C CRISPR/Cas9粒構(gòu)建
D 細胞系敲除/敲入
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研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳,，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳,。胎牛血清使用錯誤或胎牛血清的品質(zhì)不佳,。解凍過程錯誤,。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心,。懸浮細胞誤認為死細胞,。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細胞置于–80℃太久,。
研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少,， 大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷,， 以及細胞流失,。建議細胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可,。
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快速識別與處理常見細胞污染的招術(shù)：
1,、細菌：
識別：細菌在顯微鏡下為黑色細沙狀,，根據(jù)感染細菌的不同，可有不同的外形,，有球形,，鏈形，桿形等,。大家不必深究,。只要發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液渾濁變黃，培養(yǎng)瓶頂部有一層細沙一樣的東西,。就知道大事不好啦,。
處理：可在培養(yǎng)液中加相應(yīng)的抗生素處理?？梢杂盟沫h(huán)素,，慶大霉素，或者鏈霉素,，前兩者的工作濃度是50 μg/mL;鏈霉素的工作濃度是100 μg/mL。其實,，毛毛蟲說句實話,，一旦發(fā)生污染，就已經(jīng)大勢已去了,。如果細胞不是特別特別珍貴的話,，還是趁早扔了，重起爐灶吧,。所以,，zui重要的還是防范于未然。做好培養(yǎng)間,，CO2孵箱,，器皿和培養(yǎng)液的消毒滅菌工作。在操作的時候,，嚴格執(zhí)行無菌操作規(guī)范,。
2、霉菌：
識別：因為培養(yǎng)液是清亮的,，所以霉菌污染非常難以早期發(fā)現(xiàn),，等發(fā)現(xiàn)時往往已經(jīng)為時過晚了。培養(yǎng)液中慢慢地出現(xiàn)絮狀雜質(zhì),，鏡下可見呈細絲狀的團狀漂浮物,，如同風(fēng)中柳絮,。細胞仍可生長，但時間一長,，細胞的狀態(tài)就變差,。
處理：細胞一旦被霉菌污染，很難挽救,，兩性霉素B或制霉菌素都于事無補,，建議果斷舍棄該污染細胞，將環(huán)境*消毒,。
采用酒精*底地擦洗一遍CO2孵箱,。然后再用新潔爾滅擦洗一遍。把水盤里加上飽和量的硫酸銅,。
3,、支原體：
識別：多為多邊形，培養(yǎng)液一般會變渾濁,。支原體感染細胞以后,，細胞病變不很明顯，只是和你一起慢慢變老,。支原體污染后,，可影響所有的細胞生長參數(shù)。故進行實驗前,，必須確認細胞為mycoplasma-free,，實驗結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。
處理：沒有什么好處理的,。直接扔了吧,。污染到其他的細胞就虧大發(fā)了。還是那句話,，預(yù)防為主,。
4、黑蛟蟲：
識別：誰都不知道所謂的“黑膠蟲”是什么東西,。據(jù)說是納米級的細菌,。低倍下為黑色點狀,，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去,。培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會太影響,。但是如果太多了,，也會影響細胞生長和實驗結(jié)果。
處理：因為根本不知道這是什么物種,，所以也談不上什么處理方式,。建議如果細胞有可能是此種污染的話,，可以增加細胞的種板密度，以提高細胞的生存率,。
5,、真菌：
識別：真菌污染和霉菌污染差不多。一般培養(yǎng)液清亮,，所以很難早期發(fā)現(xiàn),。鏡下有時候象絲狀，有時候象珊瑚狀,。慢慢地會長出很細的黑色絲狀物,。這個時候，已經(jīng)晚了,，細胞很難救活了,。
處理：同霉菌污染一樣，沒有什么好處理的,，直接扔了吧,。然后*消毒滅菌培養(yǎng)間，CO2孵箱,，器皿和培養(yǎng)液,。
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