A-204A204 A-204A204細胞 atcc標準菌株
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基因敲除技術(shù)是20世紀80年代發(fā)展起來的,,是建立在基因同源重組技術(shù)基礎(chǔ)以及胚胎干細胞技術(shù)基礎(chǔ)上的一種新分子生物學(xué)技術(shù)?;蚯贸褪峭ㄟ^同源重組將外源基因定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位點,,以達到定點修飾改造染色體上某一基因的目的的一種技術(shù)。本文對三種基因敲除技術(shù)作比較,,描述它們的優(yōu)缺點,。
基于胚胎干細胞的同源重組技術(shù)
1、優(yōu)勢:成熟,、可靠,、精細是目前為止*一個可以滿足所有要求的打靶技術(shù)
2、局限性:
A 需要ES細胞,,目前只有小鼠有的ES細胞,,其它模式動物的ESC還不能實現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用。
B 周期長,、工作量大,、費用相對比較高
3、可提供服務(wù)類型:
A 全基因敲除模式小鼠
B 條件性基因敲除模式小鼠
C 先全敲除再條件性敲除模式小鼠
D 基因敲入模式小鼠
E ROSA位點定點轉(zhuǎn)基因
TALEN技術(shù)
1,、優(yōu)勢:基因敲除效率高,,速度快,可實現(xiàn)多物種基因敲除
2,、局限性:
基因敲入效率較低,,多基因敲除困難,系統(tǒng)構(gòu)建相對復(fù)雜,,存在脫靶風(fēng)險
3,、可提供服務(wù)類型:
A 全基因敲除大/小鼠
B 全基因敲除細胞系
EGE系統(tǒng)
1、優(yōu)勢:基因敲除/敲入效率高,,速度快,,可實現(xiàn)多基因、多物種基因敲除/敲入,,系統(tǒng)構(gòu)建簡單
2,、局限性:
存在脫靶風(fēng)險,,但通過選擇合適的sgRNA可以有效降低脫靶率,In vivo脫靶可通過傳代去除.
3,、可提供服務(wù)類型:
A 全基因/條件性基因敲除大/小鼠
B 全基因/條件性報告基因敲除/敲入大/小鼠
C CRISPR/Cas9粒構(gòu)建
D 細胞系敲除/敲入
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研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳,,常見原因可歸納為:培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳,。胎牛血清使用錯誤或胎牛血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤,。冷凍細胞解凍后,,加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞,。培養(yǎng)溫度使用錯誤,。細胞置于–80℃太久。
研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少,, 大都是因為離心過程操作上的失誤,,造成細胞的物理性損傷, 以及細胞流失,。建議細胞解凍后不要立刻離心,,應(yīng)待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。
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快速識別與處理常見細胞污染的招術(shù):
1,、細菌:
識別:細菌在顯微鏡下為黑色細沙狀,,根據(jù)感染細菌的不同,可有不同的外形,,有球形,,鏈形,桿形等,。大家不必深究,。只要發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液渾濁變黃,培養(yǎng)瓶頂部有一層細沙一樣的東西,。就知道大事不好啦,。
處理:可在培養(yǎng)液中加相應(yīng)的抗生素處理??梢杂盟沫h(huán)素,,慶大霉素,或者鏈霉素,,前兩者的工作濃度是50 μg/mL;鏈霉素的工作濃度是100 μg/mL,。其實,毛毛蟲說句實話,,一旦發(fā)生污染,,就已經(jīng)大勢已去了。如果細胞不是特別特別珍貴的話,,還是趁早扔了,,重起爐灶吧,。所以,zui重要的還是防范于未然,。做好培養(yǎng)間,,CO2孵箱,器皿和培養(yǎng)液的消毒滅菌工作,。在操作的時候,,嚴格執(zhí)行無菌操作規(guī)范。
2,、霉菌:
識別:因為培養(yǎng)液是清亮的,,所以霉菌污染非常難以早期發(fā)現(xiàn),等發(fā)現(xiàn)時往往已經(jīng)為時過晚了,。培養(yǎng)液中慢慢地出現(xiàn)絮狀雜質(zhì),,鏡下可見呈細絲狀的團狀漂浮物,如同風(fēng)中柳絮,。細胞仍可生長,,但時間一長,細胞的狀態(tài)就變差,。
處理:細胞一旦被霉菌污染,,很難挽救,兩性霉素B或制霉菌素都于事無補,,建議果斷舍棄該污染細胞,,將環(huán)境*消毒。
采用酒精*底地擦洗一遍CO2孵箱,。然后再用新潔爾滅擦洗一遍。把水盤里加上飽和量的硫酸銅,。
3,、支原體:
識別:多為多邊形,培養(yǎng)液一般會變渾濁,。支原體感染細胞以后,,細胞病變不很明顯,只是和你一起慢慢變老,。支原體污染后,,可影響所有的細胞生長參數(shù)。故進行實驗前,,必須確認細胞為mycoplasma-free,,實驗結(jié)果之數(shù)據(jù)方有意義。
處理:沒有什么好處理的,。直接扔了吧,。污染到其他的細胞就虧大發(fā)了,。還是那句話,預(yù)防為主,。
4,、黑蛟蟲:
識別:誰都不知道所謂的“黑膠蟲”是什么東西。據(jù)說是納米級的細菌,。低倍下為黑色點狀,,高倍下可看見黑色的小蟲游來游去。培養(yǎng)液也是不渾的,,一般不會太影響,。但是如果太多了,也會影響細胞生長和實驗結(jié)果,。
處理:因為根本不知道這是什么物種,,所以也談不上什么處理方式。建議如果細胞有可能是此種污染的話,,可以增加細胞的種板密度,,以提高細胞的生存率。
5,、真菌:
識別:真菌污染和霉菌污染差不多,。一般培養(yǎng)液清亮,所以很難早期發(fā)現(xiàn),。鏡下有時候象絲狀,,有時候象珊瑚狀。慢慢地會長出很細的黑色絲狀物,。這個時候,,已經(jīng)晚了,細胞很難救活了,。
處理:同霉菌污染一樣,,沒有什么好處理的,直接扔了吧,。然后*消毒滅菌培養(yǎng)間,,CO2孵箱,器皿和培養(yǎng)液,。
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