免疫沉淀技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)

時(shí)間：2015/8/1閱讀：335

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簡介：世界*品牌免疫沉淀技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝,，質(zhì)量保證,*,。
免疫沉淀技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧,，承諾客戶不成功不收費(fèi),。我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒,，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
產(chǎn)品品牌： http://www.。,。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測序?qū)嶒?yàn)流程：
材料
1,，蛋白A 或蛋白G
2，一抗
3,，免疫沉淀緩沖液：20 mM 磷酸鈉, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP40, 0.5% 脫氧膽酸鈉 and 0.02% *.
（> NOTE: 50 mM 醋酸鈉緩沖液, pH 5.0,. 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP-40 and 0.02%* 也可作為免疫沉淀的緩沖液,，能提高蛋白G的結(jié)合功效）
4，洗脫液：0.1 M 甘氨酸-HCl buffer, pH 2.5
5,， SDS-PAGE 上樣緩沖液 (pH 6.8)： 2% SDS, 62.5 mM Tris 堿, 10% 甘油, 2-5%
實(shí)驗(yàn)流程為：
1．用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養(yǎng)板上的適宜細(xì)胞,。刮去每塊板上的細(xì)胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中。
2．將每毫升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到微量離心管中,，在微量離心機(jī)上4℃以zui大速度離心15 min,。
3．收集上清（約30 ml）并加入30μg的適當(dāng)抗體，4℃搖動(dòng)免疫沉淀物1 h,。
4．加入0.9 ml的蛋白質(zhì)A-Sepharose 懸液,，4℃搖動(dòng)免疫沉淀物30 min。
5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,，再重復(fù)洗5次,。zui后，用NETN洗一次,。
6．吸出混合物的液體部分,。加入800μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸4 min,。
7．將樣品加入到大孔的不連續(xù)SDS-PAGE梯度膠中,，在10 mA的恒定電流下電泳。
8．通過考馬斯藍(lán)染色觀察蛋白質(zhì)泳帶。
9．從膠上切下目標(biāo)帶,，將其放到微量離心管中,，用1ml 50%乙腈洗兩次，每次3 min,。
10．用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì),，再將肽電洗脫。
11．通過窄孔液相色譜分離肽,。將收集的肽在ABI 477A或494A機(jī)器上進(jìn)行自動(dòng)Edman降解測序,。
在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中要保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：
(1) 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的,，而并非外源非特異蛋白,，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生；
(2) 要確?？贵w的特異性,，即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會(huì)引起共沉淀；
(3) 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中,，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的,，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來確定。

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