關(guān)鍵詞:酶聯(lián)免疫(ELISA)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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酶聯(lián)免疫(ELISA)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系,。
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測序?qū)嶒?yàn)流程：
基本原理
①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面,，并保持其免疫活性,。
②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性,，又保留酶的活性,。在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng),。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開,，zui后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物,，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來進(jìn)行定性或定量分析,。由于酶的催化頻率很高,，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度,。
ELISA可用于測定抗原,，也可用于測定抗體。
在這種測定方法中有3種必要的試劑：
①固相的抗原或抗體
②酶標(biāo)記的抗原或抗體
③酶作用的底物,。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測的具備條件,，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法。
注意事項(xiàng)
⒈ 正式試驗(yàn)時,，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗(yàn)條件,，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,。有時本底較高,，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清,、兔血清或BSA等封閉,。
⒉ 在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的,，其中包括：
⑴ 固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體,，如聚氯乙烯、聚苯乙烯,、聚丙酰胺和纖維素等,。其形式可以是凹孔平板,、試管,、珠粒等。當(dāng)前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板,。不管何種載體,，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被,，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性,，據(jù)此判明其吸附性能是否良好,。
⑵ 包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時，要求純度要好,，吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間,。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,，一般多采用4℃18～24小時,。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）進(jìn)行包被后,，在其它試驗(yàn)條件相同時,，觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度,。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg/ml,。
⑶ 酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價的滴定（見酶標(biāo)記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法"（包被物,、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度,。
⑷ 酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全,、有明顯地顯色反應(yīng),，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用,，應(yīng)注意防護(hù),。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體,，如TMB和ABTS是當(dāng)前較為滿意的供氫體,。底物作用一段時間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng),。通常底物作用時間,，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,，尤其是H2O2在臨用前加入,。
檢測步驟
ELISA用血清來檢測，首先血液要經(jīng)過至少半個小時的凝集,，然后取血清,。將酶復(fù)合物用稀釋液稀釋后，加血清及陰性,、陽性對照,，還有就是質(zhì)控品（這是嚴(yán)格的要求,，它的范圍必須在質(zhì)控范圍內(nèi)）。經(jīng)過一個小時的孵育,，然后洗板,，加底物，半個小時避光反應(yīng)后加終止液即完成反應(yīng)部分,，然后就是讀數(shù),。由數(shù)值來判斷結(jié)果的陰性或陽性。
雙抗體夾心法
一,、將特異性抗體與固相載體連接,，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
二,、加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時間,，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物,。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì),。
三、加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合,。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體,。此時固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。
四,、加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物,。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。
間接法測抗體
⑴將特異性抗原與固相載體連接,，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì),。
⑵加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物,。經(jīng)洗滌后,，固相載體上只留下特異性抗體。其他抗體及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合,，在洗滌過程中被洗去,。
⑶加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶,。洗滌后,，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體,，可用酶標(biāo)羊抗人IgG抗體,。
⑷加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。
血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM抗體的測定,。因此測定IgM抗本多用捕獲法,，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上,，在去除IgG后再測定特異性IgM,。
⑴將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM,。洗滌,。
⑵加入稀釋的血清標(biāo)本：保溫反應(yīng)后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分,。
⑶加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合,。洗滌。
⑷加入針對特異性的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合,。洗滌,。
⑸加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標(biāo)本中的特異性IgM抗體存在,，是為陽性反應(yīng),。