酵母雙（單）雜交cDNA文庫構建技術服務|實驗技術服務

時間：2015/7/1閱讀：326

關鍵詞:酵母雙(單)雜交cDNA文庫構建技術服務|實驗技術服務
簡介：世界*品牌酵母雙(單)雜交cDNA文庫構建技術服務|實驗技術服務原裝，質量保證,*,。
酵母雙(單)雜交cDNA文庫構建技術服務|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系,。
我們具備豐富的蛋白表達設計經驗及實驗操作技巧,，承諾客戶不成功不收費,。我們所有的實驗數據真實可信,，我們提供原始的表達菌株和克隆質粒，客戶可以依據我們的實驗報告重復我們的實驗結果,。
產品品牌：酵母雙(單)雜交cDNA文庫構建技術服務|實驗技術服務 http://www.,。。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測序實驗流程：
原理
酵母雙雜交技術產生以來,，它主要應用在以下幾方面：(1）檢驗一對功能已知蛋白間的相互作用。(2）研究一對蛋白間發(fā)生相互作用所必需的結構域,。(3)用已知功能的蛋白基因篩選雙雜交cDNA文庫,，以研究蛋白質之間相互作用的傳遞途徑。(4)分析新基因的生物學功能,，即以功能未知的新基因去篩選文庫,。
ProQuest系統(tǒng)依靠報告基因的轉錄激活來鑒定蛋白相互作用。將一個基因克隆到'誘餌'載體,，pDEST32,，并和GAL4蛋白的DNA結合域（DBD）表達為融合蛋白。將第二個基因或者編碼可能的相互作用子蛋白的cDNA文庫克隆到'獵物'載體,，pDEST22,，同GAL4的轉錄激活域（AD）表達為融合蛋白。當兩個蛋白相互作用時,，AD和DBD間距離被拉近,，從而激活報告基因的表達
服務流程
1) 提取總RNA，分離mRNA,，反轉錄cDNA,。
2) 將cDNA與pDONR222載體進行BP重組反應，重組產物轉化DH10B感受態(tài)細胞,。
3) 甘油保存大腸桿菌文庫,。
4) 提取大腸桿菌文庫質粒DNA，制備酵母感受態(tài)細胞
5) 大腸桿菌文庫質粒DNA轉化酵母菌,，測定轉化效率,，
6) 收集酵母轉化子，測定文庫效價,。
7) 甘油保存酵母菌文庫,。
使用優(yōu)點：在擁有相關組織基因文庫的情況下
1 ）可以用來比對病變組織更快的找到突變基因或者導致變異的蛋白,，更快的找到攻克方向。
2 ）可以用作大規(guī)模的蛋白篩選,，在較短時間內對找到某些藥物對相關組織主要的作用蛋白,，對于藥物的修飾和改進明確方向。
3 ）可以反復使用,，培養(yǎng)時間短,，適合大規(guī)模篩選使用。
4 ）作用信號是在融合基因表達后,，在細胞內重建轉錄因子的作用而給出的,，省去了純化蛋白質的繁瑣步驟。
5 ）檢測在活細胞內進行,，可以在一定程度上代表細胞內的真實情況,。檢測的結果可以是基因表達產物的積累效應，因而可檢測存在于蛋白質之間的微弱的或暫時的相互作用,。
試驗步驟:
1. Total RNA 量不要多于1mg,，用移液器取出所需RNA量到1.5ml離心管中，加RNase-free water 補足到500ul
2. 根據表3加入適當體積的OBB Buffer和Oligotex Suspension,，輕彈1.5ml離心管*混勻
3. 置于70℃水浴中3min
4. 取出置于室溫(20℃-30℃)10min
5. 13000rpm室溫離心 2min,，用移液器吸出上清到一個新的1.5ml離心管中，保留上清直到polyA被結合上,。
6. 用移液器取400ul OW2 Buffer混勻沉淀物,，將混合物轉移到 Spin Column中，RT ,，13000rpm,，離心1min
7. 將Spin Column 轉移到一個新的1.5ml離心管中，加400ul OW2,，RT,， 13000rpm，離心1min
9. 取出25ul OER Buffer(70℃)到Column中,，用移液器吹打3-4次樹脂,，室溫 13000rpm，離心1min,。
10. 測OD,并電泳定量,。
cDNA構建成功關鍵因素
1. 保證獲得數量足夠的高質量的起始RNA
2. 反轉錄成功與否及反轉錄效率是關鍵中的關鍵
3. 層析柱cDNA分級很關鍵

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