基因組文庫（Genomic Library）構建技術服務

時間：2015/7/1閱讀：369

關鍵詞:基因組文庫(Genomic Library)構建技術服務|實驗技術服務
簡介：世界*品牌基因組文庫(Genomic Library)構建技術服務|實驗技術服務原裝，質量保證,*,。
基因組文庫(Genomic Library)構建技術服務|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系,。
我們具備豐富的蛋白表達設計經驗及實驗操作技巧,，承諾客戶不成功不收費。我們所有的實驗數(shù)據(jù)真實可信,，我們提供原始的表達菌株和克隆質粒,，客戶可以依據(jù)我們的實驗報告重復我們的實驗結果。
產品品牌：基因組文庫(Genomic Library)構建技術服務|實驗技術服務 http://www.,。,。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測序實驗流程：
基因組DNA文庫包括了基因組所有順序的隨機克隆片段。一個好的基因組DNA文庫的大小應足夠大,，以便包括所有的基因DNA順序,。DNA克隆片段也應足夠大，其中包括整個基因,、連接基因及它們穩(wěn)定形式所要的側翼順序,。為了獲得高的克隆效率和較大的插入片段，λ噬菌體載體和質粒經常被使用構建基因組DNA文庫,。λ噬菌體文庫易于操作,，噬菌體載體上有多克隆位點,。λ噬菌體能容納10-50kb插入DNA，載體類型應根據(jù)所要基因組DNA的大小和用途來選擇,。
構建一個基因組DNA文庫的基本步驟：
①分離純化基因組DNA,；
②切割DNA成合適大小的片段以用于克隆,；
③載體DNA的制備,；
④把基因組DNA段和載DNA連接；
⑤包裝重組分子,；
⑥測定入噬菌體滴度,；
⑦擴增DNA文庫；
⑧評估文的質量,。
基因組文庫構建步驟：1,、載體：
l噬菌體：48.5kb,插入型(zui多可容納9kb)、取代型(可容納 38-51kb,，zui適19-20kb),， EMBL, Charon 粘性質粒(Cosmid)：4-6kb, 質粒+噬菌體的性質，可容納大片段的外源基因,，zui多可容納46kb,。酵母人工染色體克隆體系（YAC，Yeast Artificial Chromosome Cloning System）插入大小200—1000kb 2,、載體DNA的制備：高分子量的外源DNA 100-150kb載體DNA酶切反應-----載體臂的純化-----載體脫磷處理（常用BamHI）（蔗糖密度梯度離心）（堿性磷酸酶） 3,、連接和包裝：外源片段與兩臂之間的比例，包裝蛋白 4,、感染宿主菌：選擇合適的宿主菌,，LE392, NM538, NM539, KW251等 5、基因組文庫的保存和擴增： 6,、測滴度,，要在106fu以上
7、保存：氯仿4℃,，7% DMSO -70℃
需要注意：
(1)電泳時,，要選用合適的DNA Ladder，以保證電泳后可以準確定位所需分子量的DNA,。
(2)電泳以后,，應盡量縮短用紫外光照射目標DNA的時間，否則會顯著降低克隆效率,。
(3)回收DNA的時候,，應該要避免過度離心，以防止DNA被剪切,，降低文庫質量,。
方法
1,。將50μl BAC轉化菌的培養(yǎng)物接種到500ml含12。5μg/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中,，37℃ 震蕩(280rpm)培養(yǎng)12到16小時,。
2。2500g,，4℃,，離心15min，收集菌體,。
3,。用100ml冰預冷的STE重新懸浮細菌沉淀。按步驟2方法離心收集細菌,。
4,。用24ml含RNase(100μg/ml)的堿性裂解液I溶解細菌。加溶菌酶至終濃度為1mg/ml,。
5,。加入24ml新鮮配置的堿性裂解液II。蓋緊離心瓶蓋,，輕輕翻轉瓶子數(shù)次,，使內容物*混勻，冰裕5min,。
6,。加入24ml冰預冷的堿性裂解液III，蓋緊瓶蓋,，輕輕翻轉瓶子數(shù)次,，使內容物*混勻，置冰上5min,。
7,。15000g,，4℃,，離心10min，將上清轉移到另一離心瓶中,，棄沉淀,。
8。加等體積的酚：氯仿,。輕輕翻轉離心瓶數(shù)次,，混勻。3000g,，室溫離心15min,。
9,。將水相移至另一離心瓶中，加入等體積的異丙醇,，翻轉離心瓶數(shù)次,，混勻。
10,。15,，000g，室溫離心15分鐘,，回收核酸沉淀,。
11。棄上清,，用20ml 70%乙醇漂洗沉淀,。
12。棄乙醇,，風干使乙醇揮發(fā)殆盡,。
13。小心將BAC DNA沉淀溶于0,。2ml TE (pH8,。0) 中。

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