關(guān)鍵詞:基因克隆與定點(diǎn)突變技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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基因克隆與定點(diǎn)突變服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧,，承諾客戶不成功不收費(fèi)。我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒,，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
定點(diǎn)突變是指通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等方法向目的DNA段(可以是基因組，也可以是質(zhì)粒)中引入所需變化(通常是表征有利方向的變化),，包括堿基的添加,、刪除、點(diǎn)突變等。定點(diǎn)突變能迅速,、的提高DNA所表達(dá)的目的蛋白的性狀及表征,，是基因研究工作中一種非常有用的手段。
定點(diǎn)突變的比較有特色的產(chǎn)品還有Clontech公司的Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit,，需要根據(jù)準(zhǔn)備突變的質(zhì)粒自行設(shè)計(jì)兩條引物(同一方向,，對(duì)同一單鏈模版)，一條包含計(jì)劃定點(diǎn)突變的序列,，另一條引物包含質(zhì)粒上某一個(gè)單酶切位點(diǎn),，不過(guò)在單酶切位點(diǎn)中引入突變，這樣兩條引物除了所包含的突變位點(diǎn),，其他序列和質(zhì)粒上對(duì)應(yīng)位置的序列*一致,，退火后和質(zhì)粒模版結(jié)合，通過(guò)T4 DNA聚合酶延伸,，延伸反應(yīng)持續(xù)直到碰到另一條引物停止,，兩段包含突變位點(diǎn)的延伸產(chǎn)物經(jīng)T4連接成環(huán)，和模版鏈組成雜和環(huán),，帶有兩處錯(cuò)配,。單酶切反應(yīng)產(chǎn)物，直接轉(zhuǎn)化Ecoli BMH 71-18 mutS(錯(cuò)配修復(fù)缺陷株),。原來(lái)的雙鏈質(zhì)粒模版被切開(kāi)而不能轉(zhuǎn)化,，而雜和質(zhì)粒由于一條鏈上單酶切位點(diǎn)引入突變而不被切開(kāi)，保持環(huán)狀質(zhì)粒得以轉(zhuǎn)化,。轉(zhuǎn)化子的雜和雙鏈在E.coli的復(fù)制過(guò)程中分開(kāi),，再經(jīng)過(guò)一輪提質(zhì)粒、單酶切,、轉(zhuǎn)化,，zui后得到純和的突變質(zhì)粒。這個(gè)試劑盒則是利用改造單酶切位點(diǎn)使得新合成的突變質(zhì)粒不被切開(kāi)從而除去原來(lái)的模版質(zhì)粒,。
有的時(shí)候研究可能需要多個(gè)位點(diǎn)的定點(diǎn)突變,，比如改造酶的活性或者動(dòng)力學(xué)特性，研究蛋白之間的相互作用位點(diǎn)等,，單點(diǎn)突變不能滿足實(shí)驗(yàn)的需要,，重復(fù)進(jìn)行單點(diǎn)突變也非常浪費(fèi)時(shí)間。因而Stratagene公司又推出了QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis kit,。zui多一次實(shí)驗(yàn)可以引入5個(gè)定點(diǎn)突變,。這個(gè)試劑盒的原理和Clontech的相似，就是準(zhǔn)備多個(gè)帶突變的引物(同方向,，對(duì)同一單鏈模版),，退火后全部突變引物(不超過(guò)5個(gè))都結(jié)合在同一環(huán)狀單鏈模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一個(gè)引物就停止,，各片斷經(jīng)連接成環(huán),，和單鏈模版組成雜和環(huán)，DpnI消化雙鏈模版,，也消化雜和環(huán)中的模版,，只留下新合成的帶多個(gè)突變的單鏈環(huán)(mutant ssDNA)，得以轉(zhuǎn)化E.coli,，形成雙鏈質(zhì)粒,。資料表明，引入3個(gè)定點(diǎn)突變的效率為60%,，5個(gè)定點(diǎn)突變的效率為30%,。得到的其他質(zhì)粒是帶有較少定點(diǎn)突變的質(zhì)粒，以引入3個(gè)定點(diǎn)突變?yōu)槔?，就是?0% 左右的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒是帶有1-2個(gè)不同定點(diǎn)突變的質(zhì)粒(因?yàn)榇嬖?-2個(gè)引物結(jié)合模版延伸形成單鏈環(huán)的可能),。
可用DNA序列分析的方法從所得到的噬菌體中篩選出帶有突變DNA序列的突變體。在制備出含有突變體的復(fù)制型DNA后,，可以用突變的DNA段置換未突變的DNA相應(yīng)的區(qū)段,，從而得到完整的DNA突變體。
流程
定點(diǎn)突變一般須有含有待突變基因的高純度質(zhì)粒,，不少于10μg,，電泳圖清晰，達(dá)酶切及測(cè)序要求;
1.對(duì)待突變基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析,，設(shè)計(jì)突變方案;
2.根據(jù)突變方案設(shè)計(jì)合成覆蓋突變位點(diǎn)的雙向引物,，合成目的DNA兩端引物，進(jìn)行高保真PCR反應(yīng);
3.默認(rèn)情況下,，將PCR產(chǎn)物克隆至T載,，或者根據(jù)要求亞克隆至目的載體;DNA測(cè)序驗(yàn)證突變序列的正確性。
定點(diǎn)突變適用于蛋白結(jié)構(gòu)已有初步了解的基因,，比PCR隨機(jī)突變更有目的性,，也更為，簡(jiǎn)單,，同時(shí)改造基因更加"隨心所欲",。由于定點(diǎn)突變技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)中有這非常廣泛的應(yīng)用前景,，相信這個(gè)技術(shù)在不遠(yuǎn)的將來(lái)還會(huì)有更大的改進(jìn)和發(fā)展,，也必將為更多人熟悉應(yīng)用。
