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基因克隆實(shí)驗(yàn)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)

時(shí)間:2015/7/1閱讀:294
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程:
基因克隆技術(shù)包括把來(lái)自不同生物的基因同有自主復(fù)制能力的載體DNA在體外人工連接,構(gòu)建成新的重組DNA,,然后送入受體生物中去表達(dá),,從而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)和狀態(tài)的轉(zhuǎn)移和重新組合。因此基因克隆技術(shù)又稱為分子克隆,、基因的無(wú)性繁殖,、基因操作、重組DNA技術(shù)以及基因工程等,。
用重組DNA技術(shù),,將不同來(lái)源的DNA分子在體外進(jìn)行特異切割,重新連接,,組裝成一個(gè)新的雜合DNA分子,。在此基礎(chǔ)上,這個(gè)雜合分子能夠在一定的宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增,,形成大量的子代分子,,此過(guò)程叫基因克隆。
篩選方法如下:
(一)插入失活法
外源DNA段插入到位于篩選標(biāo)記基因(抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因)的多克隆位點(diǎn)后,,會(huì)造成標(biāo)記基因失活,,表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化子相應(yīng)的抗生素抗性消失或轉(zhuǎn)化子顏色改變,通過(guò)這些可以初步鑒定出轉(zhuǎn)化子是重組子或非重組子,。目前常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍(lán)白篩選法,。
(二)PCR篩選和限制酶酶切法
提取轉(zhuǎn)化子中的重組DNA分子作模板,根據(jù)目的基因已知的兩端序列設(shè)計(jì)特異引物,,通過(guò)PCR技術(shù)篩選陽(yáng)性克隆,。PCR法篩選出的陽(yáng)性克隆,用限制性內(nèi)切酶酶切法進(jìn)一步鑒定插入片段的大小,。
(三)核酸分子雜交法
制備目的基因特異的核酸探針,,通過(guò)核酸分子雜交法從眾多的轉(zhuǎn)化子中篩選目的克隆。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段,或目的基因表達(dá)蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因,。
(四)免疫學(xué)篩選法
獲得目的基因表達(dá)的蛋白抗體,,就可以采用免疫學(xué)篩選法獲得目的基因克隆。這些抗體即可是從生物本身純化出目的基因表達(dá)蛋白抗體,,也可從目的基因部分ORF片段克隆在表達(dá)載體中獲得表達(dá)蛋白的抗體,。
基因工程的載體應(yīng)具有一些基本的性質(zhì):1)在宿主細(xì)胞中有獨(dú)立的復(fù)制和表達(dá)的能力,這樣才能使外源重組的DNA段得以擴(kuò)增,。2)分子量盡可能小,,以利于在宿主細(xì)胞中有較多的拷貝,便于結(jié)合更大的外源DNA段,。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)操作中也不易被機(jī)械剪切而破壞,。3)載體分子中具有兩個(gè)以上的容易檢測(cè)的遺傳標(biāo)記(如抗藥性標(biāo)記基因),,以賦予宿主細(xì)胞的不同表型特征(如對(duì)抗生素的抗性)。4)載體本身具有盡可能多的限制酶單一切點(diǎn),,為避開外源DNA段中限制酶位點(diǎn)的干擾提供更大的選擇范圍,。若載體上的單一酶切位點(diǎn)是位于檢測(cè)表型的標(biāo)記基因之內(nèi)可造成插入失活效應(yīng),則更有利于重組子的篩選,。
DNA克隆常用的載體有:質(zhì)粒載體(plasmid),,噬菌體載體(phage),柯斯質(zhì)粒載體(cosimid),,單鏈DNA噬菌體載體(ssDNA phage ),,噬粒載體(phagemid)及酵母人工染色體(YAC)等。從總體上講,,根據(jù)載體的使用目的,,載體可以分為克隆載體,表達(dá)載體,,測(cè)序載體,,穿梭載體等。

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