關(guān)鍵詞:Western Blot wb免疫印跡檢測課題技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
簡介：世界*品牌Western Blot wb免疫印跡檢測課題技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝,，質(zhì)量保證,*,。
Western Blot wb免疫印跡檢測課題技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系,。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧,，承諾客戶不成功不收費(fèi),。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時,，我們也會提供相應(yīng)的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費(fèi)精力重復(fù)實(shí)驗(yàn)。另一方面,，我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信,，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
產(chǎn)品品牌：|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)   http://www.,。。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序?qū)嶒?yàn)流程：
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,，被檢測物是蛋白質(zhì),，“探針"是抗體,，“顯色"用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品,，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝 酸纖維素薄膜）上,，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變,。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,，與對應(yīng)的抗 體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分,。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋 白水平的表達(dá)。
Western Blot實(shí)驗(yàn)成功完成Western Blot檢測,，必須滿足4個條件：
凝膠洗脫：轉(zhuǎn)移期間蛋白質(zhì)必須從凝膠中洗脫出來,，如果蛋白質(zhì)還截留在凝膠中，將無法在膜上進(jìn)行分析
吸附到膜上：在轉(zhuǎn)移過程中蛋白質(zhì)必須吸附到膜上,，如果蛋白不吸附,，將無法在膜上進(jìn)行分析
處理期間仍截留在膜上：在轉(zhuǎn)移后的處理過程中蛋白質(zhì)必須保持吸附在印跡膜上
處理過程中可接近：被吸附的蛋白質(zhì)必須能夠與檢測試劑接觸，如果蛋白質(zhì)被掩蓋則無法檢測
成功進(jìn)行WB檢測,，則設(shè)置合適正確的對照是*的,，只要正確設(shè)置了這些對照，即可快速和準(zhǔn)確的找到WB的問題所在,，并保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性,！一般需要設(shè)置的對照如下：
陽性對照：明確表達(dá)檢測蛋白的組織或細(xì)胞，用于檢測抗體的工作效率
陰性對照：明確不表達(dá)檢測蛋白組織或細(xì)胞,，用于檢測抗體的特異性
二抗對照：不加一抗,，用于檢測二抗的特異性
內(nèi)參對照：檢測標(biāo)本的質(zhì)量和二抗系統(tǒng)
空白對照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的性質(zhì)和封閉的效果 
western blot的實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)的資料 
1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上,。 
1）轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜,，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡,。 
2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕）,，將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡,。 
3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中,，凝膠面向陰極。 
4）將上述裝置放入緩沖液槽中,，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠,。 
5）按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移。 
6）轉(zhuǎn)移結(jié)束后,，取出薄膜和凝膠,，棄去凝膠,。 
2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時取出,，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置,。 
3. 用100ml水洗滌纖維素膜，必要時可用脫色緩沖液,。 
4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時,。 
5. 室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜,。 
6. 用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中,，盡可能不留空氣。 
7．袋的一角剪一緩沖液的小口,，用透析袋夾緊,。 
8．混合：NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體（10毫升）,，加在裝薄膜的袋中,，于室溫下?lián)u動2小時（或4℃） 
9．用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜,，每次75ml,。 
10． 將連接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u動1小時,。 
11． 按步驟9洗滌,。 
12． 加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS），于室溫下?lián)u動,。 
注意事項(xiàng)： 
western blot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài),，空間結(jié)構(gòu)改變，因此那些識別空間表位的抗體不能用于western blot檢測,。這種情況可以將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白物素化,，再用酶標(biāo)記親和素進(jìn)行western blot。實(shí)驗(yàn)中取膠和膜需帶手套,。