關(guān)鍵詞:Western Blot wb免疫印跡檢測(cè)課題技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
簡(jiǎn)介：世界*品牌Western Blot wb免疫印跡檢測(cè)課題技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝,，質(zhì)量保證,*,。
Western Blot wb免疫印跡檢測(cè)課題技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系,。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧，承諾客戶(hù)不成功不收費(fèi),。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時(shí),，我們也會(huì)提供相應(yīng)的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費(fèi)精力重復(fù)實(shí)驗(yàn)。另一方面,，我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信,，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒,，客戶(hù)可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
產(chǎn)品品牌：|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)   http://www.。,。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針"是抗體,，“顯色"用標(biāo)記的二抗,。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝 酸纖維素薄膜）上,，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì),，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,，與對(duì)應(yīng)的抗 體起免疫反應(yīng),，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分,。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋 白水平的表達(dá),。
Western Blot實(shí)驗(yàn)成功完成Western Blot檢測(cè)，必須滿(mǎn)足4個(gè)條件：
凝膠洗脫：轉(zhuǎn)移期間蛋白質(zhì)必須從凝膠中洗脫出來(lái),，如果蛋白質(zhì)還截留在凝膠中,，將無(wú)法在膜上進(jìn)行分析
吸附到膜上：在轉(zhuǎn)移過(guò)程中蛋白質(zhì)必須吸附到膜上，如果蛋白不吸附,，將無(wú)法在膜上進(jìn)行分析
處理期間仍截留在膜上：在轉(zhuǎn)移后的處理過(guò)程中蛋白質(zhì)必須保持吸附在印跡膜上
處理過(guò)程中可接近：被吸附的蛋白質(zhì)必須能夠與檢測(cè)試劑接觸,，如果蛋白質(zhì)被掩蓋則無(wú)法檢測(cè)
成功進(jìn)行WB檢測(cè)，則設(shè)置合適正確的對(duì)照是*的,，只要正確設(shè)置了這些對(duì)照,，即可快速和準(zhǔn)確的找到WB的問(wèn)題所在，并保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性,！一般需要設(shè)置的對(duì)照如下：
陽(yáng)性對(duì)照：明確表達(dá)檢測(cè)蛋白的組織或細(xì)胞,，用于檢測(cè)抗體的工作效率
陰性對(duì)照：明確不表達(dá)檢測(cè)蛋白組織或細(xì)胞，用于檢測(cè)抗體的特異性
二抗對(duì)照：不加一抗，用于檢測(cè)二抗的特異性
內(nèi)參對(duì)照：檢測(cè)標(biāo)本的質(zhì)量和二抗系統(tǒng)
空白對(duì)照：不加一抗和二抗,；用于檢測(cè)膜的性質(zhì)和封閉的效果 
western blot的實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)的資料 
1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上,。 
1）轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上,，用5ml移液管在凝膠上來(lái)回滾動(dòng)去除所有的氣泡,。 
2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間,，保持濕潤(rùn)和沒(méi)有氣泡,。 
3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極,。 
4）將上述裝置放入緩沖液槽中,，并灌滿(mǎn)轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒(méi)凝膠。 
5）按照廠家所示接通電源開(kāi)始電泳轉(zhuǎn)移,。 
6）轉(zhuǎn)移結(jié)束后,，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠,。 
2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色,，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時(shí)取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置,。 
3. 用100ml水洗滌纖維素膜,，必要時(shí)可用脫色緩沖液。 
4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時(shí),。 
5. 室溫下,，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。 
6. 用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中,，盡可能不留空氣,。 
7．袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊,。 
8．混合：NGS(100微升),，印跡緩沖液中的抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中,，于室溫下?lián)u動(dòng)2小時(shí)（或4℃） 
9．用總體積300ml PBS-Tween緩沖液,，分4次在一淺盤(pán)中洗滌薄膜，每次75ml,。 
10． 將連接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）加在袋內(nèi),，于室溫下?lián)u動(dòng)1小時(shí)。 
11． 按步驟9洗滌,。 
12． 加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）,，于室溫下?lián)u動(dòng),。 
注意事項(xiàng)： 
western blot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，空間結(jié)構(gòu)改變,，因此那些識(shí)別空間表位的抗體不能用于western blot檢測(cè),。這種情況可以將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白物素化，再用酶標(biāo)記親和素進(jìn)行western blot,。實(shí)驗(yàn)中取膠和膜需帶手套,。