關(guān)鍵詞:Northern Blot技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
簡(jiǎn)介：世界*品牌Northern Blot技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝,，質(zhì)量保證,*,。
Northern Blot技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系,。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧，承諾客戶不成功不收費(fèi),。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時(shí),，我們也會(huì)提供相應(yīng)的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費(fèi)精力重復(fù)實(shí)驗(yàn)。另一方面,，我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信,，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
產(chǎn)品品牌：   http://www.,。。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
一,、 試劑準(zhǔn)備
1.  0.5M EDTA：EDTA 16.61g加ddH2 O至80ml,，調(diào)pH至8.0,，定容至100ml,。
2． 50mM NaAc：NaAc 3.4g 加ddH2O至500ml，加DEPC 0.5ml,，振蕩,，37℃高壓滅菌。
3． 5×甲醛凝膠電泳緩沖液：MOPS [3-(N-瑪琳代)丙磺酸] 10.3g加50mM NaAc 400ml,，用2N NaOH調(diào)pH至7.0,，再加入0.5M EDTA 10ml，加DEPC H2O至500ml,。無(wú)菌抽濾,，室溫避光保存。
4． 20×SSC：NaCl 175.3g,、檸檬酸三鈉88.2g,，加ddH2O至800ml，用2N NaOH調(diào)pH至7.0,，再用ddH2O定容至1000ml,。DEPC處理、高壓滅菌,。
5. 6×SSC：20×SSC 300ml加ddH2O至1000ml,。DEPC處理,高壓滅菌,。
6．50×Denhardt：聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g,、牛血清白蛋白(BSA)0.5g加dd H2O至50ml,，無(wú)菌抽濾、分裝,。
7．1M Na2HPO4：Na2HPO4-12H2O 35.81g,，加dd H2O至100ml。
8. 1M NaH2PO4： NaH2PO4-2H2O 15.6g,， 加dd H2O至100ml,。
9. 0.1M 磷酸鈉緩沖液(pH 6.6)：Na2HPO4 35.2ml加NaH2PO4 64.8ml 。
10.STE緩沖液：1M Tris-HCl(pH 8.0) 2.5ml,，0.5M EDTA,，0.5ml，5M NaCl 5ml,，加dd H2O至250ml,。
11.預(yù)雜交液：20×SSC 5ml，甲酰胺10ml,，50×Denhardt 4ml,，1M磷酸鈉緩沖液0.2ml（pH6.6），10%SDS 1ml,，總體積 20ml,。臨用前加入變性鮭魚(yú)精DNA（10mg/ml），使終濃度為4μl/ml,。
12. DEPC H2O：1000mldd H2O中加入DEPC 1ml,，充分振蕩，37℃高壓滅菌,。
二,、操作步驟
1. 總RNA提取。
2.  變性膠的制備：取瓊脂糖0.2g,，加入DEPC H2O 12.4ml,，加熱熔化，于保溫狀態(tài)下加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液4.0ml,、37%甲醛3.6ml,，混勻、制膠,。待膠凝固后,，置1×甲醛凝膠電泳緩沖液中預(yù)電泳5min。
3. 樣品制備：取總RNA4.5μl(約20-30μg) ,，加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液 4.0μl,、37%甲醛3.6μl,、甲酰胺10μl，65℃溫育15min,、冰浴5min,。加入EB（1μg/μl）1μl、上樣緩沖液2μl,。
4. 電泳：上樣,，50V電泳（電泳時(shí)間約2hr左右）。電泳結(jié)束后將膠塊置紫外燈下,，觀察RNA的完整性,，記錄18S、28S條帶的位置（離加樣孔的距離）,。
5.  將RNA從變性膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或尼龍膜：
① 按膠塊大小剪取膜一張,，用DEPC水中浸濕后，置于20×SSC中浸泡1hr,。剪去膜一角,。將膠塊切去一角，并在20×SSC浸泡15min×2次,。
② 用長(zhǎng)和寬均大于凝膠的一塊有機(jī)玻璃板作為平臺(tái),，將其放入大的干烤皿上，上面放一張Whatman 3MM濾紙,，倒入20×SSC使液面略低于平臺(tái)表面,，當(dāng)平臺(tái)上方的3MM濾紙濕透后，用玻棒趕出所有氣泡,。
③ 將凝膠翻轉(zhuǎn)后置于平臺(tái)上濕潤(rùn)的3MM濾紙中央,，3MM濾紙和凝膠之間不能滯留氣泡。
④ 用Parafilm膜圍繞凝膠四周,，以此作為屏障，阻止液體自液池直接流至膠上方的紙巾,。
⑤ 在凝膠上方放置預(yù)先已浸濕的尼龍膜,，排除膜與凝膠之間的氣泡。
⑥ 將二張已濕潤(rùn)的,、與凝膠大小相同的3MM濾紙置于膜的上方,，排除濾紙與濾膜之間的氣泡。
⑦將一疊（5-8cm厚）略小于3MM濾紙的紙巾置于3MM濾紙的上方,，并在紙巾上方放一塊玻璃,，然后用一個(gè)重約500克的重物壓在玻璃板上。其目的是建立液體自液池經(jīng)凝膠向膜上行流路,，以洗脫凝膠中的RNA并使其聚集在膜上,。
6.使上述RNA轉(zhuǎn)移持續(xù)進(jìn)行15hr左右,。在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中，當(dāng)紙巾浸濕后,，應(yīng)更換新的紙巾,。
7.轉(zhuǎn)移結(jié)束后，揭去凝膠上方的紙巾和3MM濾紙,。將膜在6×SSC中浸泡5 min,，以去除膜上殘留的凝膠。
8.將凝膠置紫外燈下,，觀察膠塊上有無(wú)殘留的RNA,。
9.膜置80℃，真空干烤1-2hr,?？靖珊蟮哪び盟芰洗芊猓?℃保存?zhèn)溆谩?br>10. 探針標(biāo)記(Prime-a-Gene Labeling System, Promega公司)：
① 取模板DNA 25ng于0.5ml離心管中,，95-100℃變性5min,，冰浴5min。
② dNTPmix的制備: 取dGTP 1μl,、dATP 1μl,、dTTP 1μl混勻。
③ 將下列反應(yīng)成份混合,，加入上述微量離心管中：
dNTPmix           2.0μl
BSA(10mg/ml )     2.0μl
5×buffer        10.0μl
Klenow 酶(5u/μl) 1.0μl
α-32P-dCTP        5.0μl
加入適量dd H2O使反應(yīng)總體積達(dá)50μl,，輕輕混勻。室溫下反應(yīng)1hr,。
11. 預(yù)雜交：將膜的反面緊貼雜交瓶,，加入預(yù)雜交液5ml，42℃預(yù)雜交3hr,。
12. 雜交：將變性的探針（95-100℃變性5min,，冰浴5min）加入到預(yù)雜交液中，42℃雜交16hr,。
13. 洗膜：
① 傾去雜交液,。
② 2×SSC/0.1%SDS室溫洗15min。
③ 0.2×SSC/0.1%SDS,，55℃洗15min×2次,。
14.壓片：將膜用dd H2O漂洗片刻，用濾紙吸去膜上水份,。用薄型塑料紙將膜包好,，置于暗盒中，在暗室中壓上X光片。暗盒置-70℃放射自顯影3～7天左右,。
注意事項(xiàng)：
操作應(yīng)該小心,，但不必緊張。用于RNA電泳,、轉(zhuǎn)膜的所有器械,、用具均須處理以除去RNAse 酶，以免樣品的降解,。轉(zhuǎn)膜時(shí),，注意膜和多孔滲水屏之間不要有氣泡。Northern blot 的優(yōu)勢(shì)在于它可檢測(cè)目的片段的大小,、是否具有可變剪切出現(xiàn),、可允許探針的部分不配對(duì)性，雜交過(guò)后的膜經(jīng)過(guò)一定的處理除去探針后還可保存很長(zhǎng)時(shí)間再次雜交使用,。