關(guān)鍵詞:ELISA即酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
簡(jiǎn)介：世界*品牌ELISA即酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝,，質(zhì)量保證,*,。
ELISA即酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系,。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
ELISA可用于測(cè)定抗原,，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體,，②酶標(biāo)記的抗原或抗體,，③酶作用的底物。根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的性狀以及檢測(cè)的具備條件,，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。
一雙抗體夾心法
雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原zui常用的方法,，操作步驟如下：
⑴將特異性抗體與固相載體連接,，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
⑵加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合,，形成固相抗原復(fù)合物,。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。
⑶加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合,。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體,。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。
⑷加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物,。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量,。
根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物,，即可用雙抗原夾心法測(cè)定標(biāo)本中的抗體,。
二雙位點(diǎn)一步法
在雙抗體夾心法測(cè)定抗原時(shí)，如應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體,，則在測(cè)定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步（圖15-5）,。這種雙位點(diǎn)一步不但簡(jiǎn)化了操作，縮短了反應(yīng)時(shí)間,，如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體,，測(cè)定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測(cè)定抗原的ELISA提高到新水平,。
在一步法測(cè)定中,，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)（hookeffect），類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶現(xiàn)象,。當(dāng)標(biāo)本中待測(cè)抗原濃度相當(dāng)高時(shí),，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物,，所得結(jié)果將低于實(shí)際含量,。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
三間接法測(cè)抗體
間接法是檢測(cè)抗體zui常用的方法,，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體,，故稱為間接法。操作步驟如下：
⑴將特異性抗原與固相載體連接,，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì),。
⑵加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物,。經(jīng)洗滌后,，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合,，在洗滌過(guò)程中被洗去,。
⑶加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合,，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶。洗滌后,，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量,。例如欲測(cè)人對(duì)某種疾病的抗體，可用酶標(biāo)羊抗人IgG抗體,。
⑷加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量,。
本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體,。
四競(jìng)爭(zhēng)法
競(jìng)爭(zhēng)法可用于測(cè)定抗原,，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例,，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合,，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：
⑴將特異抗體與固相載體連接,，形成固相抗體,。洗滌。
⑵待測(cè)管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液,，使之與固相抗體反應(yīng),。如受檢標(biāo)本中無(wú)抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合,。如受檢標(biāo)本中含有抗原,，則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會(huì)與固相抗體結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會(huì),，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少,。參考管中只加酶標(biāo)抗原，保溫后,，酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)zui充分的量,。洗滌。⑶加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原zui多,，故顏色zui深,。參考管顏色深度與待測(cè)管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量,。待測(cè)管顏色越淡,，表示標(biāo)本中抗原含量越多。
五捕獲法測(cè)IgM抗體
血清中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在,，后者會(huì)干擾IgM抗體的測(cè)定,。因此測(cè)定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上,，在去除IgG后再測(cè)定特異性IgM,。操作步驟如下：
⑴將抗人IgM抗體連接在固相載體上,，形成固相抗人IgM。洗滌,。
⑵加入稀釋的血清標(biāo)本：保溫反應(yīng)后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分,。
⑶加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合,。洗滌。
⑷加入針對(duì)特異性的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合,。洗滌,。
⑸加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標(biāo)本中的特異性IgM抗體存在,，是為陽(yáng)性反應(yīng),。
六應(yīng)用親和素和生物素的ELISA
親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取,。分子量60kD,，每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成，可以和4個(gè)生物素分子親密結(jié)合?，F(xiàn)在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）,。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244.31,，存在于蛋黃中,。用化學(xué)方法制成的衍生物，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide,，BNHS）可與蛋白質(zhì),、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素與生物素的結(jié)合,，雖不屬免疫反應(yīng),，但特異性強(qiáng)，親和力大,，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定,。由于1個(gè)親和素分子有4個(gè)生物素分子的結(jié)合位置，可以連接更多的生物素化的分子,，形成一種類似晶格的復(fù)合體,。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯(lián)起來(lái)，就可大大提高ELISA的敏感度,。
親和素－生物素系統(tǒng)在ELISA中的應(yīng)用有多種形式,，可用于間接包被，亦可用于終反應(yīng)放大,?？梢栽诠滔嗌舷阮A(yù)包被親和素,，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結(jié)合，通過(guò)親和素－生物素反應(yīng)而使生物素化的抗體或抗在相化,。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量,，而且使其結(jié)合點(diǎn)充分暴露。另外,，在常規(guī)ELISA中的酶標(biāo)抗體也可用生物素化的抗體替代,，然后連接親和素－酶結(jié)合物，以放大反應(yīng)信號(hào),。
ELISA 普遍用作非放射性同位素的成鍵化驗(yàn). 在這種方法中,，通常標(biāo)準(zhǔn)配體是固定的，通過(guò)加入溶液相受體或蛋白質(zhì)來(lái)使之成鍵. 通過(guò)加入與受體特異性反應(yīng)的抗體來(lái)定量成鍵的受體,，而且zui初抗體的量以加入第二種能顯色的抗體測(cè)量. 第二種抗體能識(shí)別抗體的末端,，在其末端的堿性磷酸酯或過(guò)氧化物酶等與酶發(fā)生反應(yīng)，從而使溶液顯色.
注意事項(xiàng) :
正式實(shí)驗(yàn)時(shí),，應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件,，待測(cè)樣品應(yīng)做一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,。有時(shí)本底較高,，說(shuō)明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清,，兔血清,、BSA或OVA等封閉。