滑膜細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)

時(shí)間：2015/5/15閱讀：1662

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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
方法
1. 將切下的組織在手術(shù)臺(tái)上請(qǐng)將標(biāo)本放入低溫生理鹽水中(靜止),，在手術(shù)完成時(shí)將標(biāo)本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中帶回實(shí)驗(yàn)室,。
2. 在超凈臺(tái)中將標(biāo)本放入培養(yǎng)皿中，加入α-MEM洗滌,。
3. 獲得組織切開(kāi),，仔細(xì)辨認(rèn)于關(guān)節(jié)反折處及增生的白色光滑的滑膜組織，附于關(guān)節(jié)軟骨面的增生的血管翳也為滑膜組織(可作另一管消化),，仔細(xì)剔除脂肪組織，用α-MEM洗二次(以去除紅細(xì)胞),，放在小青瓶中用解剖剪銳性切碎,。
4. 用雙倍獲得組織的體積含有4 mg/mlⅠ型膠原酶的α-MEM消化37℃孵育120分鐘(在此期間震動(dòng)混勻數(shù)次)
5. 30分鐘后收集*管細(xì)胞：細(xì)胞懸液經(jīng)70 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，用1500-2000轉(zhuǎn)離心6分鐘,，上清為Ⅰ型膠原酶加入未過(guò)濾網(wǎng)的組織,，繼續(xù)用于消化。
6. 離心管底細(xì)胞用α-MEM離心洗滌2次,，每次用α-MEM重懸浮后用1500-2000轉(zhuǎn),，離心6分鐘，zui后一次用記數(shù)板觀察到有細(xì)胞,。細(xì)胞zui終懸浮于含有10%胎牛血清的α-MEM中,，接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
7. 60鐘后收集第二管細(xì)胞：細(xì)胞懸液經(jīng)70 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾,，用1500-2000 rpm離心6分鐘,；用α-MEM洗2次,，每次用α-MEM重懸浮后用1500-2000 rpm離心6分鐘，zui后一次用記數(shù)板觀察細(xì)胞并計(jì)數(shù),。細(xì)胞zui終懸浮于α-MEM含有10%胎牛血清中,，接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
8. 必要時(shí)可做第三管細(xì)胞收集,；并立即作原代滑膜細(xì)胞培養(yǎng),。
9. 每2-3天換液一次。
實(shí)驗(yàn)材料：
1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：大鼠,、兔,，人手術(shù)切除的關(guān)節(jié)等；
2. 清洗液：不含Ca2+ 和Mg 2+ 的1×PBS,，添加100IU/ml青霉素,、100μg/ml鏈霉素，pH7.2,；
3. 培養(yǎng)液：RPMI1640培養(yǎng)基,，補(bǔ)加15%小牛血清；
實(shí)驗(yàn)方法：
1. 將大鼠處死后,，用75%酒精消毒,；
2. 用手術(shù)剪剖開(kāi)其四肢皮膚與肌肉，暴露長(zhǎng)骨兩端的關(guān)節(jié),，取出關(guān)節(jié)面滑膜組織置于盛有緩沖液的培養(yǎng)皿中,；
3. 剔除滑膜組織外層結(jié)構(gòu)及周邊軟骨組織，用緩沖液洗2—3次,；
4. 將滑膜組織置于盛有少量小牛血清的培養(yǎng)皿中,，剪碎成1mm×1mm×1mm大小的植塊；
5. 將制備的植塊接種到螺旋口培養(yǎng)瓶中,。反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,，使植有組織塊的一面朝上，加入培養(yǎng)液,，蓋好瓶蓋,。將培養(yǎng)瓶放入含5%CO2的培養(yǎng)箱中在37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)；
6. 培養(yǎng)4h后,，組織塊較牢黏附于瓶底時(shí),，再輕輕反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng),；
7. 培養(yǎng)3d后換培養(yǎng)液,。
注意事項(xiàng)
1. 用0.25% trypsin或0.25% trypsin＋ 0.02% EDTA 或 collagenaseⅠ或collagenaseⅡ消化細(xì)胞或合用，只有單用collagenaseⅠ有用,、,；
2. 機(jī)械法很難獲得細(xì)胞,；
3. 全培用α-MEM或RPMI1640或DMEM，加10%胎牛血清,。不能用小牛血清,，胎牛血清用國(guó)產(chǎn)即可；
4. 必須用Ca2+-free的PBS,。

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