人核因子κB亞基p65親和肽（NF-κB p65）ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)
人核因子κB亞基p65親和肽（NF-κB p65）ELISA試劑盒僅供體外研究使用,、不用于臨床診斷!
檢測(cè)范圍： 1.56 ng/ml - 100 ng/ml,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線請(qǐng)取用以下濃度值：100 ng/ml,，50 ng/ml，25 ng/ml,，12.5 ng/ml,，6.25 ng/ml，3.12 ng/ml,，1.56 ng/ml,。
zui低檢測(cè)限：0.39 ng/ml
實(shí)驗(yàn)原理:用純化的NF-κB p65抗體包被微孔板，制成固相載體,，往微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素化的NF-κB p65抗體、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物（TMB）顯色,。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的NF-κB p65呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（ 值），計(jì)算樣品濃度。
特異性:本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的人NF-κB p65,，且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng),。
預(yù)期應(yīng)用:ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿,、組織勻漿或其它相關(guān)生物液體中NF-κB p65含量,。
人核因子κB亞基p65親和肽（NF-κB p65）ELISA試劑盒組成及試劑配制
1.酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2.標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制,。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解,，其濃度為500 ng/ml,，將其稀釋為100 ng/ml后，再做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋）,，分別配制成100 ng/ml,，50 ng/ml，25 ng/ml,，12.5 ng/ml,，6.25 ng/ml，3.12 ng/ml,，1.56 ng/ml,，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 ng/ml。如配制50 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）100 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類推。
3.樣品稀釋液：1×20ml,。
4.檢測(cè)稀釋液A：1×10ml,。
5.檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
6.檢測(cè)溶液A：1×120 /瓶（1:100）,。臨用前以檢測(cè)稀釋液A 1:100稀釋（如：10 檢測(cè)溶液A / 990 檢測(cè)稀釋液A）,，充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（100 /孔）,，實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制 0.1-0.2ml,。
7.檢測(cè)溶液B：1×120 /瓶（1:100）,。臨用前以檢測(cè)稀釋液B 1:100稀釋,。稀釋方法同檢測(cè)溶液A。
8.底物溶液：1×10ml/瓶,。
9.濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10.終止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）,。
11.覆膜：5張
12.使用說(shuō)明書(shū)：1份
自備物品：
1.蒸餾水或去離子水,，濾紙
2.酶標(biāo)儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）
3.微量加液器及吸頭,，EP管
標(biāo)本的采集及保存：
1.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于 1000 g離心15分鐘,，取上清即可檢測(cè),，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
2.血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4 過(guò)夜后于1000 g離心20分鐘,，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
3.組織勻漿：將動(dòng)物的組織標(biāo)本先用PBS洗滌，去除多余血液,，勻漿化后放在5~10 ml PBS中于-20℃放置過(guò)夜,，第二天，經(jīng)過(guò)二次反復(fù)凍融破膜,，將勻漿物5000x g離心5分鐘,，取上清即可檢測(cè)。
4.其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000 g離心20分鐘,，取上清即可檢測(cè),，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
注：以上標(biāo)本均應(yīng)密封保存,，保存應(yīng)小于1周，-20不應(yīng)超過(guò)1個(gè)月,，-80不應(yīng)超過(guò)2個(gè)月,；標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè),。
操作步驟：
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,，各試劑均應(yīng)平衡至室溫，試劑不能直接在37 溶解,；試劑或樣品配制時(shí),，均需充分混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡,。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測(cè)樣品含量,，如樣品濃度過(guò)高時(shí)，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋,，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍,，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
1.加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測(cè)樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液 100,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100,，注意不要有氣泡，加樣 時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，37溫育2小時(shí),。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效
性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。
2.棄去液體,，甩干，不用洗滌,。每孔加檢測(cè)溶液A工作液 100（臨用前配制）,，酶標(biāo)板加上覆膜，37溫育1小時(shí),。
3.棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板 3次,，每次浸泡1-2分鐘,，大約400/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。
4.每孔加檢測(cè)溶液B工作液（臨用前配制）100,，加上覆膜，37溫育1小時(shí),。
5.棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板5次,，方法同步驟3,。
6.每孔加底物溶液90，酶標(biāo)板加上覆膜37 避光顯色（反應(yīng)時(shí)間控制在15-30分鐘,，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色,，后3-4孔梯度不明顯時(shí)，即可終止）,。
7.每孔加終止溶液50,，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物 液的加入順序相同,。
8.立即用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度（ 值）。
注：
1.試劑準(zhǔn)備：所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫,，使用后請(qǐng)立即按照說(shuō)明書(shū)要求保存試劑,。實(shí)驗(yàn)操作中請(qǐng)使用一次性的吸頭，避免交叉污染,。
2.加樣：加樣或加試劑時(shí),，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的 “預(yù)溫育”時(shí)間,，從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性,。一次加樣時(shí)間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。
3.溫育：為防止樣品蒸發(fā),，實(shí)驗(yàn)時(shí)將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi),以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài),；同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。
4.洗滌：洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干,，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù),。
5.試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請(qǐng)手甩幾下或少時(shí)離心處理,，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測(cè)溶液A工作液,、檢測(cè)溶液B工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配制使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。請(qǐng) 配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測(cè)溶液A時(shí),，一次不要小于10）,，以避免由于不準(zhǔn)確稀 釋而造成濃度誤差；請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測(cè)溶液A工作液,、檢測(cè)溶液B工作液。
6.反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如,，每隔10分鐘）,，如顏色較深,，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過(guò)強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù),。
7.底物：底物請(qǐng)避光保存,，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
洗板方法:
1.自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。
2.手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；根據(jù)需要,重復(fù)此過(guò)程數(shù)次,。
計(jì)算:各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本 值扣除空白孔 值后作圖（七點(diǎn)圖），如設(shè)置復(fù)孔,，則 應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)）,， 值為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析,，如 curve expert 1.3，根據(jù)樣品 值,，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,，乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,，將樣品的 值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度,。
說(shuō)明:
1.在儲(chǔ)存及孵育過(guò)程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,，試劑避免受到微生物的污染，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果,。
2.小心吸取試劑并嚴(yán)格遵守給定的孵育時(shí)間和溫度。請(qǐng)注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品,，酶結(jié)合物或底物時(shí),，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時(shí)間,，從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性,。而且,，洗滌不充分將影響試驗(yàn)結(jié)果。
3.試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃,，部分試劑保存于2-8℃,，具體以標(biāo)簽上的標(biāo)示為準(zhǔn)。
4.濃洗滌液會(huì)有鹽析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。
5.剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì),，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響,。
6.中,、英文說(shuō)明書(shū)可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn),。
7.所有的樣品都應(yīng)管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測(cè)裝置,。
8.有效期：6個(gè)月
