人胰島素樣生長因子1 （IGF-1）ELISA試劑盒說明書
人胰島素樣生長因子1 （IGF-1）ELISA試劑盒僅供研究使用
概述:胰島素樣生長因子（Insulin-like growth factor, IGF）,，因其與胰島素氨基酸序列有同源性而得名,，是一類參與調節(jié)碳水化合物、脂類,、蛋白質的代謝,，促進細胞增殖和分化的小分子多肽類生長因子。近20年來,，IGFs在腫瘤發(fā)生過程中的作用逐漸受到關注,，成為新的研究熱點。胰島素樣生長因子1（Insulin likegrowthfactor1,，IGF-1）,又稱生長激素刺激素C,，是一種相對分子質量為7600的單鏈非糖多肽。zui先發(fā)現(xiàn)它的功能是其能調節(jié)體細胞生長,，后又發(fā)現(xiàn)它是一種重要的細胞生長,分化過程中的調節(jié)蛋白,。在哺乳動物中,，成熟的IGF-1結構相當保守,，在人,、豬、牛以及犬類動物中其蛋白質結構100%相同,。IGF-1主要由肝臟分泌,，以與IGFBP組成結合物的形式存在于血液和其它體液中。人IGF-1的氨基酸序列與大鼠及人比較,，分別有99%和94%相同,。
檢測范圍：6.25 μg/ml - 400 μg/ml
zui低檢測限：1.56 μg/ml
實驗原理:用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體,，往包被抗IGF-1抗體的微孔中依次加入標本或標準品,、生物素化的抗IGF-1抗體、HRP標記的親和素,，經過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的IGF-1呈正相關,。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度,。
預期應用：ELISA法定量測定人血清,、血漿、細胞培養(yǎng)上清或其它相關生物液體中IGF-1含量,。
說明:
1.濃洗滌液低溫保存會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
2.試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）,；2-8℃（頻繁使用時）,。
3.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正?，F(xiàn)象,，不會對實驗結果造成任何影響。
4.中,、英文說明書可能會有不一致之處,，請以英文說明書為準。
人胰島素樣生長因子1 （IGF-1）ELISA試劑盒組成及試劑配制 :
1.酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）,。
2.標準品（Standard）：2瓶（凍干品）,。
3.樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。
4.生物素標記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶,。
5.辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶,。
6.生物素標記抗體（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）
7.辣根過氧化物酶標記親和素（HRP-avidin）：1×120μl瓶（1：100）
8.底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶,。
9.濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
10.終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）,。
需要而未提供的試劑和器材:
1.高速離心機
2.電熱恒溫培養(yǎng)箱
3.蒸餾水，容量瓶等
4.標準規(guī)格酶標儀
5.干凈的試管和Eppendof管
6.系列可調節(jié)移液器及吸頭,，一次檢測樣品較多時,，用多通道移液器
標本的采集及保存:
1.細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000xg離心20分鐘，取上清即可檢測,，或將標本放于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融。
2.血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000xg離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融,。
3.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標本采集后30分鐘內于2-8°C1000xg離心15分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融,。
注：標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。
標準品的稀釋原則：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為400 μg/ml，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋400 μg/ml,，200 μg/ml，100 μg/ml,，50 μg/ml,，25 μg/ml，12.5 μg/ml,，6.25 μg/ml,，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 μg/ml，臨用前15分鐘內配制,。如配制200 μg/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）400 μg/ml的上述標準品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。
標本的稀釋原則：首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量,，確定適當?shù)南♂尡稊?shù),。只有稀釋至標準曲線的范圍內，檢測的結果才是準確的,。稀釋的過程中,，應做好詳細的記錄。zui后計算濃度時,，稀釋了“N”倍,，標本的濃度應再乘以“N”,。
辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋,，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應多配制0.1-0.2ml,。如10μl辣根過氧化物酶標記親和素加990μl辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時內配制,。
生物素標記抗體的稀釋原則：臨用前以生物素標記抗體稀釋液稀釋,，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應多配制0.1-0.2ml,。如10μl生物素標記抗體加990μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時內配制,。
操作步驟:實驗開始前,請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?試劑或樣品稀釋時,均需混勻,混勻時盡量避免起泡,。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時,，用樣品稀釋液進行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1.加樣：分別設空白孔,、標準孔,、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl,，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻,，酶標板加上蓋或覆膜,，37℃反應120分鐘。為保證實驗結果有效性,，每次實驗請使用新的標準品溶液,。
2.棄去液體,，甩干，不用洗滌,。每孔加生物素標記抗體工作液 100μl（取1μl生物素標記抗體加99μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時內配制）,，37℃,60分鐘,。
3.溫育60分鐘后，棄去孔內液體,，甩干,，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘,，350μl/每孔,，甩干。
4.每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記抗體工作液） 100μl,，37℃,，60分鐘。
5.溫育60分鐘后,，棄去孔內液體,，甩干，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘,，350μl/每孔，甩干,。
6.依序每孔加底物溶液90μl,，37℃避光顯色（30分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色,，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）。
7.依序每孔加終止溶液50μl,，終止反應（此時藍色立轉黃色）,。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性,，底物反應時間到后應盡快加入終止液,。
8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內進行檢測,。
注：
1.用戶在初次使用試劑盒時,，應將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底,。
2.每次實驗留一孔作為空白調零孔,，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調OD值至零,。
3.為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜,。
4.未使用完的酶標板或者試劑,，請于2-8℃保存。標準品,、生物素標記抗體工作液,、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品,、生物素標記抗體工作液或,、辣根過氧化物酶標記親和素工作液,。
5.建議檢測樣品時均設雙孔測定,，以保證檢測結果的準確性。
洗板方法:
自動洗板：如果有自動洗板機,，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內,浸泡1-2分鐘,。根據(jù)需要,重復此過程數(shù)次。
計算:以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標）,，OD值為縱坐標（普通坐標）,，在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度,。
注意事項:
1.當混合蛋白溶液時應盡量輕緩,，避免起泡。
2.洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性,。
3.一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。
4.請每次測定的同時做標準曲線,，做復孔。
5.如標本中待測物質含量過高,，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
6.在配制標準品,、檢測溶液工作液時,，請以相應的稀釋液配制，不能混淆,。
7.底物請避光保存,。
8.不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑
特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人IGF-1，且與其他相關蛋白無交叉反應,。
有效期：6個月
