人維生素D（VD）ELISA檢測(cè)試劑盒只能用于科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷
人維生素D（VD）ELISA檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書
檢測(cè)原理:試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,。往預(yù)先包被維生素D（VD）抗體的包被微孔中,，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品,、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體,，經(jīng)過(guò)溫育并*洗滌。用底物TMB顯色,，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的維生素D（VD）呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值）,，計(jì)算樣品濃度。
樣品收集,、處理及保存方法:
1.血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后,，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離,。
2.血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清,。
3.細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4.組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清,。
5.保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝,，凍存于-20℃,，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。
自備物品
1.37℃恒溫箱
2.酶標(biāo)儀（450nm）
3.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL、20-200uL,、200-1000uL
操作注意事項(xiàng)
1.試劑盒保存在2-8℃,，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶,，這屬于正常現(xiàn)象,，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用,。
2.實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
3.濃度為0的S0號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品即可視為陰性對(duì)照或者空白,；按照說(shuō)明書操作時(shí)樣本已經(jīng)稀釋5倍,，zui終結(jié)果乘以5才是樣本實(shí)際濃度。
4.嚴(yán)格按照說(shuō)明書中標(biāo)明的時(shí)間,、加液量及順序進(jìn)行溫育操作,。
5.所有液體組分使用前充分搖勻。
人維生素D（VD）ELISA檢測(cè)試劑盒組成:
名稱96孔配置48孔配置備注
微孔酶標(biāo)板12 孔×8 條12 孔×4 條無(wú)
標(biāo)準(zhǔn)品0.3mL*6 管0.3mL*6 管無(wú)
樣本稀釋液6mL 3mL 無(wú)
檢測(cè)抗體-HRP 10mL 5mL 無(wú)
20×洗滌緩沖液25mL 15mL 按說(shuō)明書進(jìn)行稀釋
底物A 6mL 3mL 無(wú)
底物B 6mL 3mL 無(wú)
終止液6mL 3mL 無(wú)
封板膜2 張2 張無(wú)
說(shuō)明書1 份1 份無(wú)
自封袋1 個(gè)1 個(gè)無(wú)
注：標(biāo)準(zhǔn)品（S0-S5）濃度依次為：0,、3,、6、12,、24,、48 ng/mL
試劑的準(zhǔn)備:20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1:20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水,。
洗板方法
1.自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL,，浸泡1min，洗板5次,。
2.手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,，在吸水紙上拍干,，如此洗板5次。
操作步驟:
1.從室溫平衡20min 后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,；
3.樣本孔先加待測(cè)樣本10μL,，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加,。
4.除空白孔外,，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
5.棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液,，靜置1min，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）,。
6.每孔加入底物A、B各50μL,，37℃避光孵育15min,。
7.每孔加入終止液50μL，15min 內(nèi),，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值,。
結(jié)果判斷:繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo),，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值,。
試劑盒性能:
1.準(zhǔn)確性：標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值,，大于等于0.9900。
2.靈敏度：zui低檢測(cè)濃度小于1.0 ng/mL,。
3.特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng),。
4.重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%,。
5.貯藏：2-8℃,，避光防潮保存。
6.有效期：6個(gè)月
