Elisa操作要點總結,，的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA 檢測結果準確可靠的必要條件,。ELISA 中用的蒸餾水或去離子水,，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質量的本公司要求使用的純化水電導率小于1.5μs/cm,。
1.標本的采取和保存:大部分ELISA 檢測均以血清為標本,。血清標本可按常規(guī)方法采集，應注意避免溶血,，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質,，以HRP 為標記的ELISA 測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色,。血清標本宜在新鮮時檢測,。如有細菌污染,，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應,。一般說來,，在5天內(nèi)測定的血清標本可放置于4℃，標本在冰箱中保存時間過長導致血清IgG 聚合,，使間接法的試劑本底加深,。超過一周測定的需－20℃保存。凍結血清融解后,，蛋白質局部濃縮,，分布不均，應充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡,?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢吮緫入x心或過濾，澄清后再檢測,。反復凍融會使抗體效價跌落,，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存,。保存血清自采集時就應注意無菌操作,，也可加入適當防腐劑。
抗凝不*的標本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性,，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑,。
2.加樣:加樣時應將所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部,，并注意不可濺出,。
3.保溫:在建立ELISA 方法作反應動力學研究時，實驗表明,，兩次抗原抗體反應一般在37℃經(jīng)1-2 小時,，產(chǎn)物的生成可達。為避免蒸發(fā),，板上應加蓋,，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應板不宜疊放,，以保證各板的溫度都能迅速平衡,。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成,，采用水浴會造成值偏高或花板,。另外溫育中還有邊緣效應，邊上的值會偏高,，建議為了客觀的判斷結果,，將質控放在非邊緣位置,。
4.洗滌:洗滌在ELISA 過程中雖不是一個反應步驟，但卻決定著實驗的成敗,。ELSIA 就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的,。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質,。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的,，而在洗滌時應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來?？梢哉f在ELISA 操作中，洗滌是zui主要的關鍵技術,，應引起操作者的高度重視,，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎,。
洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液,。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團,，也含親水基團,，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質與固相載體的結合,，并借助于親水基團和水分子的結合作用,，使蛋白質回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體,。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20,，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時,，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度,。
洗板時注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋,，應按要求稀釋,，所用的水電導率在1.5us/cm 之下，洗液如果結晶應待其融解后配制,。保證洗板浸泡時間為40 秒左右,，孔內(nèi)液體被洗板機吸收得越干凈洗滌效果更好，手工洗板防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡,。
5.顯色和比色:TMB 經(jīng)HRP 作用后,，約40 分鐘顯色達，隨即逐漸減弱,，至2 小時后即可*消退至無色,。TMB 的終止液有多種,，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12-24 小時）不褪,，是目視判斷的良好終止劑,。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色,，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值,。酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指于測讀ELISA 結果吸光度的光度計,。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度,、讀數(shù)的準確性、重復性,、度和可測范圍,、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可到0.001,，準確性為±1%,，重復性達0.5%。酶標儀不應安置在陽光或強光照射下,，操作時室溫宜在15~30℃,，使用前先預熱儀器15-30 分鐘，測讀結果更穩(wěn)定,。
Elisa操作要點總結測讀A值時,，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm 波長,。有的酶標儀可用雙波長式測讀,，即每孔先后測讀兩次，*次在zui適波長（W1）,，第二次在不敏感波長（W2）,，兩次測定間不移動ELISA 板的位置，zui終測得的A 值為兩者之差（W1-W2）,。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾,。
