Elisa操作要點總結(jié),，的試劑,，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA 檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件,。ELISA 中用的蒸餾水或去離子水,，包括用于洗滌的,，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的本公司要求使用的純化水電導(dǎo)率小于1.5μs/cm,。
1.標(biāo)本的采取和保存:大部分ELISA 檢測均以血清為標(biāo)本。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集,，應(yīng)注意避免溶血,，紅細(xì)胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP 為標(biāo)記的ELISA 測定中，溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色,。血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測,。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng),。一般說來，在5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃,，標(biāo)本在冰箱中保存時間過長導(dǎo)致血清IgG 聚合,，使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需－20℃保存,。凍結(jié)血清融解后,，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均,，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡,。混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾,，澄清后再檢測,。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測,，宜少量分裝冰存,。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑,。
抗凝不*的標(biāo)本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性,，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑。
2.加樣:加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA 板孔的底部,，避免加在孔壁上部,，并注意不可濺出。
3.保溫:在建立ELISA 方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時,，實驗表明,，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2 小時，產(chǎn)物的生成可達,。為避免蒸發(fā),，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔,，反應(yīng)板不宜疊放,，以保證各板的溫度都能迅速平衡,。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確,。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會造成值偏高或花板。另外溫育中還有邊緣效應(yīng),，邊上的值會偏高,，建議為了客觀的判斷結(jié)果，將質(zhì)控放在非邊緣位置,。
4.洗滌:洗滌在ELISA 過程中雖不是一個反應(yīng)步驟,，但卻決定著實驗的成敗。ELSIA 就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的,。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,，而在洗滌時應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來,。可以說在ELISA 操作中,，洗滌是zui主要的關(guān)鍵技術(shù),，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌,，不得馬虎,。
洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的,，非離子型洗滌劑既含疏水基團,，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合,，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合,，并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài),，從而脫離固相載體,。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間,，高于0.2%時,，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。
洗板時注意各種試劑盒的洗液不要混用,。如果洗液需要稀釋,，應(yīng)按要求稀釋，所用的水電導(dǎo)率在1.5us/cm 之下,，洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其融解后配制,。保證洗板浸泡時間為40 秒左右，孔內(nèi)液體被洗板機吸收得越干凈洗滌效果更好,，手工洗板防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡,。
5.顯色和比色:TMB 經(jīng)HRP 作用后,，約40 分鐘顯色達，隨即逐漸減弱,，至2 小時后即可*消退至無色,。TMB 的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止,。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12-24 小時）不褪,，是目視判斷的良好終止劑。此外,，各類酸性終止液則會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色,，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀,，通常指于測讀ELISA 結(jié)果吸光度的光度計,。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性,、重復(fù)性,、度和可測范圍、線性等等,。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可到0.001,，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達0.5%,。酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強光照射下,，操作時室溫宜在15~30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30 分鐘,，測讀結(jié)果更穩(wěn)定,。
Elisa操作要點總結(jié)測讀A值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰,，如OPD用492nm 波長,。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次,，*次在zui適波長（W1）,，第二次在不敏感波長（W2），兩次測定間不移動ELISA 板的位置,，zui終測得的A 值為兩者之差（W1-W2）,。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。
