elisa原理與技術(shù)
酶免疫技術(shù)是以酶標(biāo)記的抗體或抗原為主要試劑的方法,，是標(biāo)記免疫技術(shù)的一種。免疫技術(shù)是利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行的檢測方法,，即應(yīng)用制備好的特異性抗原或抗體作為試劑,，以檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原,。
一,、酶免疫技術(shù)的分類
酶免疫技術(shù)是以酶標(biāo)記的抗體或抗原為主要試劑的方法,，是標(biāo)記免疫技術(shù)的一種。免疫技術(shù)是利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行的檢測方法,，即應(yīng)用制備好的特異性抗原或抗體作為試劑,，以檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原。它的特點(diǎn)是具有高度的特異性和敏感性,。如將抗原或抗體用可以微量檢測的標(biāo)記物（例如放射性核素、熒光素,、酶等）進(jìn)行標(biāo)記,，則在與標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原反應(yīng)后，可以不必測定抗原抗體復(fù)合物本身,，而測定復(fù)合物中的標(biāo)記物,，通過標(biāo)記物的放大作用，進(jìn)一步提高了免疫技術(shù)的敏感性,。這種標(biāo)記免疫技術(shù)一般分為兩類,，一類用于組織切片或其他標(biāo)本中抗原或抗體的定位;另一類用于液體標(biāo)本中抗原或抗體的測定。前者屬于免疫組化技術(shù)（immunohistochemical chnique）范疇,，后者則稱為免疫測定（immunoassay）,。
酶免疫測定根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要分離結(jié)合的與游離的酶標(biāo)記物而分為均相（homogenous）和異相（heterogenous）兩種類型，實(shí)際上所有的標(biāo)記免疫測定均可分成這兩類,。以標(biāo)記抗體檢測標(biāo)本中的抗原為例,，按照簡單的形式是在試劑抗體過量的情況下進(jìn)行，其反應(yīng)式如下：
Ab*+ Ag——Ab*Ag+Ab*
Ab*Ag代表結(jié)合的標(biāo)記物,， Ab*為游離的標(biāo)記物,。如在抗原反應(yīng)后,，先把Ab*Ag與Ab* 分離;然后測定Ab*Ag或Ab*中的標(biāo)記物的量，從而推算出標(biāo)本中的抗原量,，這種方法稱為異相法,。如在抗原抗體反應(yīng)后Ab*Ag中的標(biāo)記物* 失去其特性，例如酶失去其活力,，熒光物質(zhì)不顯熒光,，則不需要進(jìn)行Ab*Ag 與Ab*的分離，可以直接測定游離的Ab* 量,，從而推算出標(biāo)本中的Ag含量,，這種方法稱為均相法。
在異相法中,，抗原和抗體如在液體中反應(yīng),，分離游離和結(jié)合的標(biāo)記物的方法有許多種。與放射免疫測定相類似的液相異相酶免疫技測定,，在某些激素等定量測定中也有應(yīng)用,。但常用的酶免疫測定法為固相酶免疫測定。其特點(diǎn)是將抗原或抗體制成固相制劑,，這樣在與標(biāo)本中抗體或抗原反應(yīng)后,，只需經(jīng)過固相的洗滌，就可以達(dá)到抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)的分離,，大大簡化了操作步驟,。這種被稱為EL1SA 的檢測技術(shù)成為目前臨床檢驗(yàn)中應(yīng)
用較廣的免疫測定方法。
二,、方法類型和操作步驟
ELISA可用于測定抗原,，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：① 固相的抗原或抗體,，② 酶標(biāo)記的抗原或抗體,，③ 酶作用的底物，根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測的條件,，可設(shè)計(jì)出各種不
同類型的檢測方法,。
（一）雙抗體夾心法：
雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法,，操作步驟如下：
?。?）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì),。
?。?）加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與同相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物,。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì),。
（3）加酶標(biāo)抗體：使同相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合,。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體,。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。
?。?）加底物：酶催化底物成為有色產(chǎn)物,。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。
根據(jù)同樣原理,，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物,，即可雙抗原夾心法測定標(biāo)本中的抗體。
?。ǘ╇p位點(diǎn)一步法：
在雙抗體夾心法測定抗原時(shí),，如應(yīng)用針對抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步,。這種雙位點(diǎn)一步法不但簡化了操作,，
縮短了反應(yīng)時(shí)間，如果使用高親和力的單克隆抗體,，測定的敏感性和特異性也顯著提高,。單克隆抗體的應(yīng)用使測定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測定中,，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)（hook effect）,，類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后滯現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測抗原濃度相當(dāng)高時(shí),，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合,，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實(shí)際含量,。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
?。ㄈ╅g接法測抗體 ：
間接法是檢測抗體時(shí)zui常用的方法,，其原理為利用酶標(biāo)記的抗-抗體檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體。故稱為間接法,。操作步驟如下：
?。?）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原,。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì),。
（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物,。經(jīng)洗滌后,，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合,，在洗滌過程中被洗去,。
（3）加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合,，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶,。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量,。例如： 欲測人對某種疾病的抗體,，可用酶標(biāo)羊抗人lgG抗體。
?。?）加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量,。
本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體,。
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競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體,。以測定抗原為例,，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競爭與同相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比,。操作步驟如下：
?。?）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體,。洗滌,。
