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平滑肌細胞原代培養(yǎng)方法
動物:大鼠150～180g,2～3只
操作步驟
大鼠頸椎脫臼致死
固定
消毒胸腹部
大組織鑷,組織剪切開胸腹部皮膚
另一組織鑷,組織剪切開胸腹部,并切除部分胸壁以利暴露
眼科鑷和眼科彎剪分離胸腹主動脈并放入盛有Hank's液的細胞培養(yǎng)皿中,轉(zhuǎn)入無菌室.或先用生理鹽水漂洗,再放Hank's液中,轉(zhuǎn)入無菌室
眼科直鑷和彎鑷去除血凝塊和血管外膜層.
放入另一盛有Hank's液的細胞培養(yǎng)皿中,剪去血管外的小分支
放入含20%胎牛血清的DMEM中,眼科直剪剪開血管腔,以眼科彎鑷輕輕擦拭內(nèi)膜層,以去除內(nèi)皮細胞
放入另一含20%胎牛血清的DMEM中,用眼科彎剪剪碎血管組織至1mm
用吸管把組織塊轉(zhuǎn)入玻璃培養(yǎng)皿中,均勻貼壁,組織塊的間距為0.5cm
蓋好瓶蓋,輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,讓瓶底朝上,并向瓶內(nèi)注入適量培養(yǎng)液,于37 C孵箱內(nèi)放置4～5小時,使得組織塊干涸,并與瓶底貼附
將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放,使組織塊*浸入培養(yǎng)液中,繼續(xù)靜置3～5天,切勿移動.待有細胞從組織塊周圍游離出后換液
平滑肌細胞傳代
傳代時間:大部分組織塊長出細胞暈,并與相鄰細胞暈相接觸時就可以傳代
傳代步驟:
倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液
用D-Hank's液洗兩遍
加2-3滴0.25%胰蛋白酶消化液,平放培養(yǎng)瓶,在倒置纖微鏡下觀察細胞消化情況,可見到細胞質(zhì)回縮,細胞間隙增大時迅速翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,使細胞脫離消化液
注意:
初次傳代對胰酶敏感,加入消化液30s,即消化充分,以后2分鐘左右
細胞消化完成后,用吸管反復抽吸打散細胞
中止消化:加入DMEM培養(yǎng)液3滴管,用吸管反復吹打瓶壁細胞
離心:1500 X5分鐘
倒掉液體,加D-Hank's液洗一次,再加10mL DMEM培養(yǎng)液,用吸管抽吸吹打分散細胞,分裝于2個培養(yǎng)瓶.在倒置纖微鏡下可見圓形細胞.放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)
血管平滑肌細胞的凍存和復蘇
凍存時間:較早期傳代,以防細胞因為傳代次數(shù)過多而造成細胞衰老或發(fā)生改變,以保持實驗條件的一致性.
凍存方法:凍存前24小時更換培養(yǎng)液,凍存時要將密閉好的凍存管依次放于:
4 C 2小時
-20 C 2.5小時
液氮表面 2小時
浸入液氮
培養(yǎng)細胞的鑒定
1,形態(tài)學鑒定:
用相差顯微鏡常規(guī)觀察細胞生長形態(tài)以及生長規(guī)律.并依據(jù)常規(guī)制作電鏡標本進行觀察
電鏡觀察結(jié)果:細胞形態(tài)不規(guī)則,胞漿內(nèi)有肌絲,縱向排列,有密區(qū),具備平滑肌細胞特征
2,免疫組織化學鑒定:
特異性鼠抗α-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體,采用SP法對細胞爬片進行免疫組織化學染色
免疫組織化學鑒定結(jié)果:
鏡下觀察到細胞爬片,可見細胞漿內(nèi)大量平行陽性染色胞核不著色.所有細胞染色,結(jié)果均為陽性
培養(yǎng)試劑的配制
Hank's液 （單位g）
CaCl2 0.14
KCl 0.4
KH2PO4 0.06
MgSO4.7H2O 0.10
NaCl 8.0
NaHCO3 0.35
Na2HPO4.12H2O 0.12
D-glucose 1.0
Phenol red 0.01
將 CaCl2先溶解在100mL的ddH2O中,其它成分溶在750 mL的ddH2O中,混勻（用磁力攪拌器攪拌至溶解）,定容至1000mL.高壓蒸氣消毒10分鐘,4℃冰箱保存.
D-Hank's液 （單位:g）
KCl 0.40
KH2PO4 0.06
NaCl 8.0
NaHCO3 0.35
Na2HPO4.12H2O 0.08
Phenol red 0.02
將以上成分溶于900mL ddH2O中,充分混勻,加ddH2O至1000 mL.高壓蒸氣消毒10分鐘,4℃冰箱保存.
青霉素,鏈霉素液配制
青霉素80萬U加Hank's液至80 mL,終濃度1萬u/ mL
鏈霉素100萬U（相當于1g）加Hank's液至100 mL,終濃度10mg/mL
分裝后至-20℃冰箱保存.
DMEM培養(yǎng)液
900 mL ddH2O于1000 mL容器中,將DMEM粉1包倒入容器中,盛粉袋用50 mL ddH2O分次沖洗,也倒入容器,磁力攪拌溶解.
加NaHCO3
調(diào)PH至7.2
加青,鏈霉素至終濃度100u/mL 和100ug/mL
0.22umX50濾膜過濾（負壓泵抽吸）,4℃冰箱保存.
小牛,胎牛血清滅活
55℃水浴箱30分鐘,置4℃冰箱保存
滅活前放于-20℃冰箱保存待用
臨用前加入DMEM液中
血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells,，VSMCS ）位于動脈壁中膜,，它對管壁的完整性和調(diào)節(jié)血管的緊張性起著重要作用.在經(jīng)典的單層培養(yǎng)系統(tǒng)中,，VSMCS 離開了在體內(nèi)與細胞外基質(zhì)共同構(gòu)成的三維立體生長環(huán)境，因而所表現(xiàn)出的生物學特性與在體狀態(tài)存在較大的差異.我們在VSMCS 單層培養(yǎng)的基礎上，將兔主動脈VSMCS 置于膠原凝膠中,，使其在體外與細胞外基質(zhì)形成一個整體,，觀察其在三維狀態(tài)下的生物學特征，為構(gòu)造結(jié)構(gòu)和功能與在體血管中膜相似的中膜組織,，zui終形成組織工程化血管提供實驗依據(jù).
動脈平滑肌細胞的培養(yǎng)
一,、血管平滑肌細胞的培養(yǎng)
血管平滑肌細胞培養(yǎng)常用的方法有貼塊法（explant）和酶解離法（enzyme disperse）。貼塊法具有獲得平滑肌細胞純度高,，量多,，操作簡便的優(yōu)點。但用貼塊法易使平滑肌細胞胞質(zhì)內(nèi)肌絲喪失,，亞細胞器增加,。相反，酶解離法,，由于酶的作用使細胞間失去連接,，細胞內(nèi)肌絲含量豐富，保持收縮型狀態(tài),。培養(yǎng)平滑肌細胞常取材于兔,、豬、鼠,、猴的胸腹主動脈段,。
1．貼塊法
方法：動物經(jīng)頸動脈放血后，在無菌操作下迅速取出胸腹主動脈段,，置于含Hank's液的平皿中漂洗3次,，將凝塊洗干凈后剝除外膜的纖維脂肪層，然后縱行切開血管,，刮除內(nèi)膜即內(nèi)皮細胞迅速撕下中膜內(nèi),、中層，切成約1mm寬的小條,，浸泡在含血清的Hank's液中,，并將撕下小組織塊種植于培養(yǎng)瓶壁。置于37℃恒溫箱,，2h左右,，取出培養(yǎng)瓶加入20%胎牛血清的培養(yǎng)液，再放回培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)4天,。4天后可見細胞從組織中遷移游出,。
不同動物血管結(jié)構(gòu)有差異，豬和猴較易操作,，但小動物如兔,、鼠因其血管小,，血管壁薄等特點，使之難以分離,。另外組織塊太薄,，不易粘附培養(yǎng)基，也使細胞較難生長,。為了保證培養(yǎng)的成功,，應注意：①種植組織塊的數(shù)目，如75cm2的長頸瓶組織塊不得少于30 ,；②根據(jù)培養(yǎng)細胞的種屬加入適量的不同血清,，一般可加入牛血清，若小牛血清增殖效果差,，應加胎牛血清（FBS）,，通常濃度為10%～20%；③培養(yǎng)基的選擇：常用的有DMEM（Dulbecco's modified Eagles'medium）,，M199培養(yǎng)基,。培養(yǎng)兔的平滑肌細胞用DMEM效果較好。
2．酶解離法
沿動脈縱軸切開后,，刮除內(nèi)皮細胞撕下中膜的內(nèi)2/3,，注意不要混入內(nèi)皮細胞，將組織塊切成1-2mm2,，放入加有3mg/ml膠原酶的無血清M199培養(yǎng)基中,，37℃，0.5～1.5h,。離心去上清,，重復上述消化步驟，然后再離心（9000r,4min）,，收集細胞,，在5%～10%同種血清或胎牛血清的M199培養(yǎng)基中調(diào)整細胞數(shù)，然后轉(zhuǎn)入30～90mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng),，對于兔子應加入高濃度的谷氨酰胺（0.2g/L）較佳,。不同研究者在培養(yǎng)基、酶濃度以及消化時間等的選擇都有很大的差異,。
二,、動脈平滑肌的特性
由于貼塊法和解離法處理方式不同，在細胞培養(yǎng)的zui初階段細胞形態(tài)和性質(zhì)存在差異,。隨著培養(yǎng)時間的延長,，培養(yǎng)環(huán)境趨于一致，細胞特性上也趨于近似,。
光學倒置顯微鏡下觀察：原代平滑肌細胞形狀多樣,，一般常為梭形,、帶形、三角形或星形,。貼塊法培養(yǎng),，細胞可于2周后長成單層；而酶解離只需6～7天,，鏡下可見明顯“峰-谷”樣生長。
透射電子顯微鏡下觀察：貼塊法,，細胞多為合成型,，肌絲減少，胞體縮小,，細胞胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),、游離核糖體、線粒體等亞細胞器逐漸增多,。消化法,，細胞初期表現(xiàn)為收縮型，細胞內(nèi)核位于中心,，胞質(zhì)內(nèi)含豐富的肌絲及致密度體,。亞細胞器少，且位于細胞邊緣處,，基底膜zui初未見,，后來逐漸形成。傳代后,，細胞逐漸轉(zhuǎn)為合成型,，胞體增大且變扁平，核增大,，核小體數(shù)目增加,，亞細胞器也增加，肌絲開始減少,，占胞內(nèi)35.4%～11.5%,甚至更少,。
另外，在體外實驗中,，來自幼齡動物（兔,，豬）的血管平滑肌增殖生長早且快，相反,，老齡動物則生長緩慢,。在生化性質(zhì)方面，收縮型細胞比合成型細胞的β-極密度脂蛋白（β-VLDL）對其受體結(jié)合能力強,，低密度脂蛋白（LDL）分解降低,，即脂質(zhì)容易在胞質(zhì)沉著,。此外，像基底膜中的肝素樣物質(zhì),、膽固醇代謝等也有改變,。合成型細胞內(nèi)色素C氧化還原酶成倍增加，酸性磷酸酶亦呈3～4倍增加,，說明兩類細胞不僅在形態(tài)學上,，在生化、生理反應方面也發(fā)生了較大改變,。
