G蛋白偶聯(lián)受體很久以來(lái)一直被認(rèn)為是以單體的形式存在，并且與配體結(jié)合進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的,。然而,，近年來(lái)，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明,，有的GPCR可形成同源二聚體或異源二聚體而發(fā)揮作用,。雖然這種聚集在與G蛋白結(jié)合方面的作用還存在爭(zhēng)議，但是許多GPCR確實(shí)可形成二聚體/寡聚體是毋庸置疑的,，尤其是C類受體（class C receptor）,。二聚體/寡聚體除了可能參與G蛋白結(jié)合，還可能在GPCR脫敏,、GPCR合成后從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌到細(xì)胞表面等過(guò)程中發(fā)揮作用,。

二聚化/寡聚化的發(fā)現(xiàn)給新藥研發(fā)提供了新的思路，尤其是對(duì)于異源聚集,。在這種模式下,，藥物可能與一個(gè)GPCR結(jié)合，并共同活化了第二個(gè)GPCR,，引起細(xì)胞反應(yīng),。如果我們只用其中一個(gè)GPCR去做篩選，很可能看不到有意義的結(jié)果,。同時(shí),，受體聚集的提出，給孤兒受體（orphan GPCR）也提出了新的解釋,?；蛟S，這些孤兒受體可與其它GPCR形成二聚體/寡聚體,，作為parter,，而不是以單體的形式發(fā)揮作用。

有兩個(gè)不同的方向進(jìn)行受體二聚化/寡聚化檢測(cè),，一個(gè)是體外檢測(cè),，一個(gè)是活細(xì)胞檢測(cè)。CO-IP是應(yīng)用zui廣泛的檢測(cè)二聚化/寡聚化的體外方法,?；罴?xì)胞檢測(cè)的方法主要基于能量共振轉(zhuǎn)移（RET）原理，包括FRET,、pbFRET ,、BRET、HTRF（TR-FRET）等,。Tag-lite將SNAP-Tag、HaloTag和HTRF技術(shù)結(jié)合起來(lái),，可以非常方便可靠地檢測(cè)活細(xì)胞受體二聚化/寡聚化,。

檢測(cè)原理

同源二聚體的檢測(cè)
構(gòu)建SNAP和GPCR的共表達(dá)載體,，轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，可表達(dá)SNAP-GPCR的融合蛋白,。然后,，加入分別標(biāo)記了Tb和Acceptor熒光染料的底物，則部分GPCR標(biāo)記了Tb（Tb-GPCR）,，部分標(biāo)記了Acceptor熒光染料（Acceotor-GPCR）,。如果GPCR可以形成同源二聚體，配體刺激后,，兩個(gè)GPCR會(huì)相互靠近并偶聯(lián),。Tb-GPCR與Acceptor-GPCR之間發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，檢測(cè)到HTRF信號(hào),，見(jiàn)圖1,。

圖1：GPCR同源二聚體檢測(cè)模式

異源二聚體的檢測(cè)
分別構(gòu)建SNAP-GPCR1和CLIP-GPCR2的表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染,，可得到表達(dá)SNAP-GPCR1和CLIP-GPCR2的細(xì)胞,。加入標(biāo)記了Tb的SNAP底物和標(biāo)記了Acceptor熒光染料的CLIP底物，細(xì)胞表面的受體為T(mén)b-SNAP-GPCR1和Acceptor-CLIP-GPCR2,。如果GPCR形成異源二聚體,，配體刺激后，GPCR1/2相互靠近發(fā)揮作用,。Tb與Acceptor之間發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移,，檢測(cè)到HTRF信號(hào)，見(jiàn)圖2,。

HaloTag與SNAP相似,，也是一個(gè)自身標(biāo)記的酶，通過(guò)與標(biāo)記了熒光的底物反應(yīng),，將自身標(biāo)記上熒光,。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們也可以構(gòu)建HaloTag與GPCR的表達(dá)載體,。

檢測(cè)特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)
• 活細(xì)胞水平的檢測(cè)
• 檢測(cè)背景低：時(shí)間分辨熒光的檢測(cè)方式,，沒(méi)有熒光染料自身的交叉干擾和來(lái)自樣品自發(fā)熒光的干擾
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠：FRET技術(shù)使檢測(cè)結(jié)果反映的是真正的受體聚集，而不是僅僅相互靠近
• 不需要抗體：Tag-lite利用的SNAP技術(shù),，不需要抗體來(lái)確定實(shí)驗(yàn)的特異性

應(yīng)用領(lǐng)域
• 受體二聚化/寡聚化分析
• 孤兒受體的研究

應(yīng)用實(shí)例

C類GPCR：GPCRGABAB1與GABAB2的異源二聚化檢測(cè)
分別構(gòu)建GABAB1與SNAP-Tag和GABAB2與HaloTag的表達(dá)載體,，共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。蛋白表達(dá)后,，固定SNAP的底物BG-Tb濃度不變,，配制不同濃度的HaloTag的底物Halo-Red濃度，將兩種底物混合后加入細(xì)胞。孵育1h后,，檢測(cè)HTRF信號(hào),，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

GABAB1與GABAB2形成異源二聚體發(fā)揮作用,。隨著Halo-Red濃度的加大,，有更多的能量從Tb轉(zhuǎn)移到Red染料上，HTRF信號(hào)增強(qiáng),，直到達(dá)到平衡,。

圖3：GABAB1與GABAB2的異源二聚化檢測(cè)

A類GPCR：多巴胺D2與Delta 阿片的異源二聚化檢測(cè)
分別構(gòu)建Delta阿片與SNAP-Tag和多巴胺與HaloTag的表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,。蛋白表達(dá)后,，固定SNAP的底物BG-Tb濃度不變，配制不同濃度的HaloTag的底物Halo-Red濃度,，將兩種底物混合后加入細(xì)胞,。孵育1h后，檢測(cè)HTRF信號(hào),，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示,。

圖4：GABAB1與GABAB2的異源二聚化檢測(cè)

多巴胺D2與Delta阿片形成異源二聚體發(fā)揮作用。隨著Halo-Red濃度的加大,，有更多的能量從Tb轉(zhuǎn)移到Red染料上,，HTRF信號(hào)增強(qiáng)，直到達(dá)到平衡,。