G蛋白偶聯(lián)受體很久以來一直被認為是以單體的形式存在,，并且與配體結(jié)合進行信號轉(zhuǎn)導的。然而,，近年來,，越來越多的實驗證據(jù)表明，有的GPCR可形成同源二聚體或異源二聚體而發(fā)揮作用,。雖然這種聚集在與G蛋白結(jié)合方面的作用還存在爭議,，但是許多GPCR確實可形成二聚體/寡聚體是毋庸置疑的，尤其是C類受體（class C receptor）,。二聚體/寡聚體除了可能參與G蛋白結(jié)合,，還可能在GPCR脫敏,、GPCR合成后從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌到細胞表面等過程中發(fā)揮作用。

二聚化/寡聚化的發(fā)現(xiàn)給新藥研發(fā)提供了新的思路,，尤其是對于異源聚集,。在這種模式下，藥物可能與一個GPCR結(jié)合,，并共同活化了第二個GPCR,，引起細胞反應。如果我們只用其中一個GPCR去做篩選,，很可能看不到有意義的結(jié)果,。同時，受體聚集的提出,，給孤兒受體（orphan GPCR）也提出了新的解釋,。或許,，這些孤兒受體可與其它GPCR形成二聚體/寡聚體,，作為parter，而不是以單體的形式發(fā)揮作用,。

有兩個不同的方向進行受體二聚化/寡聚化檢測,，一個是體外檢測，一個是活細胞檢測,。CO-IP是應用zui廣泛的檢測二聚化/寡聚化的體外方法,。活細胞檢測的方法主要基于能量共振轉(zhuǎn)移（RET）原理,，包括FRET,、pbFRET 、BRET,、HTRF（TR-FRET）等,。Tag-lite將SNAP-Tag、HaloTag和HTRF技術(shù)結(jié)合起來,，可以非常方便可靠地檢測活細胞受體二聚化/寡聚化,。

檢測原理

同源二聚體的檢測
構(gòu)建SNAP和GPCR的共表達載體，轉(zhuǎn)染入細胞,，可表達SNAP-GPCR的融合蛋白,。然后，加入分別標記了Tb和Acceptor熒光染料的底物,，則部分GPCR標記了Tb（Tb-GPCR）,，部分標記了Acceptor熒光染料（Acceotor-GPCR）。如果GPCR可以形成同源二聚體,，配體刺激后,，兩個GPCR會相互靠近并偶聯(lián),。Tb-GPCR與Acceptor-GPCR之間發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，檢測到HTRF信號,，見圖1,。

圖1：GPCR同源二聚體檢測模式

異源二聚體的檢測
分別構(gòu)建SNAP-GPCR1和CLIP-GPCR2的表達載體，共轉(zhuǎn)染,，可得到表達SNAP-GPCR1和CLIP-GPCR2的細胞。加入標記了Tb的SNAP底物和標記了Acceptor熒光染料的CLIP底物,，細胞表面的受體為Tb-SNAP-GPCR1和Acceptor-CLIP-GPCR2,。如果GPCR形成異源二聚體，配體刺激后,，GPCR1/2相互靠近發(fā)揮作用,。Tb與Acceptor之間發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，檢測到HTRF信號,，見圖2,。

HaloTag與SNAP相似，也是一個自身標記的酶,，通過與標記了熒光的底物反應,，將自身標記上熒光。在這個實驗中,，我們也可以構(gòu)建HaloTag與GPCR的表達載體,。

檢測特點和優(yōu)勢
• 活細胞水平的檢測
• 檢測背景低：時間分辨熒光的檢測方式，沒有熒光染料自身的交叉干擾和來自樣品自發(fā)熒光的干擾
• 實驗結(jié)果可靠：FRET技術(shù)使檢測結(jié)果反映的是真正的受體聚集,，而不是僅僅相互靠近
• 不需要抗體：Tag-lite利用的SNAP技術(shù),，不需要抗體來確定實驗的特異性

應用領域
• 受體二聚化/寡聚化分析
• 孤兒受體的研究

應用實例

C類GPCR：GPCRGABAB1與GABAB2的異源二聚化檢測
分別構(gòu)建GABAB1與SNAP-Tag和GABAB2與HaloTag的表達載體，共轉(zhuǎn)染細胞,。蛋白表達后,，固定SNAP的底物BG-Tb濃度不變，配制不同濃度的HaloTag的底物Halo-Red濃度,，將兩種底物混合后加入細胞,。孵育1h后，檢測HTRF信號,，實驗結(jié)果如圖3所示,。

GABAB1與GABAB2形成異源二聚體發(fā)揮作用。隨著Halo-Red濃度的加大,，有更多的能量從Tb轉(zhuǎn)移到Red染料上,，HTRF信號增強，直到達到平衡,。

圖3：GABAB1與GABAB2的異源二聚化檢測

A類GPCR：多巴胺D2與Delta 阿片的異源二聚化檢測
分別構(gòu)建Delta阿片與SNAP-Tag和多巴胺與HaloTag的表達載體,，共轉(zhuǎn)染細胞,。蛋白表達后，固定SNAP的底物BG-Tb濃度不變,，配制不同濃度的HaloTag的底物Halo-Red濃度,，將兩種底物混合后加入細胞。孵育1h后,，檢測HTRF信號,，實驗結(jié)果如圖4所示。

圖4：GABAB1與GABAB2的異源二聚化檢測

多巴胺D2與Delta阿片形成異源二聚體發(fā)揮作用,。隨著Halo-Red濃度的加大,，有更多的能量從Tb轉(zhuǎn)移到Red染料上，HTRF信號增強,，直到達到平衡,。